藜麥黃酮提取及其抗氧化活性研究

蘆曉芳，李亞諾，宋兵澤，楊美紅，岳愛琴，趙晉忠

（山西農業大學，山西晉中 030801）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）是一種雙子葉藜科藜屬植物，具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽性，適合高海拔（3 000~4 000 m）的高原或山地地區生長［1］。藜麥的營養成分豐富，富含蛋白質、淀粉、脂肪、維生素、礦物質等，其中含量為0.4%~0.7%的藜麥黃酮具有清除體內氧自由基、降低膽固醇、改善血液循環等功效［2，3］。近年來，世界范圍內對藜麥的種植與研究越來越多，但對藜麥黃酮類物質的研究相對欠缺。目前藜麥黃酮的常用提取方法有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等［4-9］，為進一步提高藜麥黃酮的提取效率及最大程度避免其活性組分損耗，本研究以白藜麥子粒為原料，基于超聲輔助提取法，增加外加負壓，探尋不同超聲時間、固液比及負壓對藜麥黃酮提取率的影響，通過響應面優化獲得超聲-負壓輔助提取藜麥黃酮的最佳工藝條件，為藜麥黃酮的提取提供試驗數據支撐。粗藜麥黃酮經分離純化后得到的藜麥總黃酮，考察其體外抗氧化活性，意在證明藜麥黃酮的潛在利用價值，為藜麥黃酮在醫藥和功能食品開發上提供理論依據，使藜麥的應用范圍及商業價值增大，達到藜麥資源的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁標準品，合肥博美生物科技有限責任公司；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4 型數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；UV1100 型分光光度計，長沙科美分析儀器有限公司；DL-0506 型低溫冷卻液循環泵，河南兄弟儀器設備有限公司；YRE2000E 型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環水真空泵，鄭州予華儀器制造有限公司；YXSF-500 型中藥粉碎機，上海百航實業有限公司；KM-300DE 型中文液晶臺式超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司；VEGA ⅡRSU 型掃描電子顯微鏡，TESCAN公司。

1.3 藜麥去脂預處理

藜麥粉碎過孔徑0.33 mm篩，按固液比1∶5（g/mL）加入石油醚，浸泡過夜，反復3~4 次，至石油醚無色為止。真空抽濾，室溫下揮干濾餅石油醚，即得去脂藜麥粉末，備用。

1.4 標準曲線繪制

采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法繪制標準曲線［10］。精確稱取0.015 0 g 蘆丁標準樣品，70%乙醇溶解，定容25 mL，即得到濃度為0.6 mg/mL 的蘆丁標準溶液。

吸取一定量蘆丁標準品溶液，分別加入70%乙醇、5%亞硝酸鈉、10%硝酸鋁、4%氫氧化鈉于具塞試管中，70%乙醇定容至10 mL。全波段掃描蘆丁標準品溶液，確定最大吸收波長。最大吸收波長處分別測定不同濃度蘆丁標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，建立回歸方程。

1.5 藜麥黃酮含量測定

按照“1.4”的方法配制溶液，在最大吸收波長處測定吸光度。

式中，C為藜麥黃酮濃度（mg/mL），V為提取液體積（mL），N為稀釋倍數，m為藜麥的質量（g）。

1.6 單因素試驗

1.6.1 固液比對藜麥黃酮提取量的影響 準確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，分別設定固液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80（g/mL，下同），乙醇體積分數70%，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下超聲20 min。

1.6.2 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響 準確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，按固液比1∶20 加入體積分數70%的乙醇溶液，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下，分別設定超聲時間為10、20、30、40、50 min。

1.6.3 負壓輔助對藜麥黃酮提取量的影響 準確稱取1.000 0 g 脫脂藜麥粉，分別設定負壓0.03、0.04、0.05、0.06、0.07 MPa，按固液比1∶20 加入70%的乙醇，超聲功率270 W，超聲溫度50 ℃的條件下超聲30 min。

1.7 響應面試驗

以超聲時間（A）、固液比（B）和負壓（C）3 個條件為自變量因素，根據藜麥黃酮提取單因素試驗的結果得到3 個水平，按表1 的條件設計17 組響應面優化試驗，通過Design-Expert 12.0 軟件對試驗結果進行回歸分析，得到藜麥黃酮提取的優化條件。

表1 響應面中心組合試驗因素及水平

1.8 藜麥黃酮的純化

藜麥黃酮的純化方法：乙酸乙酯萃取藜麥黃酮粗提濃縮液，旋干溶劑，干法上樣過硅膠層析柱，丙酮洗脫，得到純化藜麥黃酮。

1.9 粉末SEM 表征

掃描電子顯微鏡用于分析和描述藜麥細胞壁結構在不同條件（超聲時間、固液比、負壓）提取前后的變化。SEM表征檢測條件為：加速電壓（HV）20.0 kV，放大（MAG）200 kx，工作距離（WD）7.08 mm。

1.10 藜麥黃酮抗氧化活性

將樣品母液稀釋不同倍數，以維生素C 為陽性對照分析藜麥黃酮的抗氧化活性。采用普魯士藍顯色法［11］測定藜麥黃酮還原Fe3+能力；藜麥黃酮對清除DPPH 自由基的能力按白紅進等［12］的方法測定。

式中，A0表示未加樣品樣液的空白溶劑混合液的吸光度；A1表示未加樣品溶液的DPPH 溶液的吸光度；A2表示藜麥皂苷樣品或抗壞血酸與DPPH 試劑混合液的吸光度。

1.11 數據處理

采用Microsoft Office 軟件進行數據統計，利用Origin 2017 軟件及Design-Expert12.0 軟件進行數據分析，ChemSketch12.0 軟件繪制藜麥黃酮結構圖。

2 結果與分析

2.1 最佳檢測波長的確定

蘆丁標準品全波段掃描結果如圖1 所示。由圖1 可知，蘆丁最大吸收波長為507 nm，即藜麥黃酮的最大吸收波長。

圖1 蘆丁標準品全波段掃描

2.2 藜麥總黃酮標準曲線繪制

蘆丁不同濃度吸光度曲線（蘆丁標準曲線）如圖2 所示，線性擬合得蘆丁溶液濃度對吸光度的回歸方程：y=8.250 86x+0.015 54，R2=0.991 93。

圖2 蘆丁標準曲線（n=3）

2.3 藜麥黃酮提取單因素試驗

2.3.1 固液比對藜麥黃酮提取量的影響 由圖3 可知，藜麥黃酮提取量隨著提取溶劑體積的增大呈先增大后減小的趨勢。當固液比為1∶20 時，藜麥黃酮提取量最大，為（4.75±0.062）mg/g，可能是固液比為1∶20 時有足夠的溶劑將藜麥黃酮完全溶出；當固液比為1∶5~1∶20 時，溶劑量不足以將樣品中的黃酮全部溶出；當固液比為1∶20~1∶80 時，增加的提取溶劑量可能會導致藜麥樣品中雜質的溶出，影響降低藜麥黃酮的提取量。

圖3 固液比對藜麥黃酮提取量的影響

2.3.2 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響 由圖4可知，藜麥黃酮提取量隨著超聲時間的增加整體上呈先增加后減小的趨勢。當超聲時間小于30 min時，黃酮提取量隨著超聲時間的增加而增大；當超聲時間為30 min 時藜麥黃酮提取量最大，為（5.21±0.025）mg/g；當超聲時間大于30 min 時，黃酮提取量降低。原因可能為在短時間內，超聲時間越長，提取液與脫脂藜麥粉接觸時間越長，黃酮溶出率越高，當黃酮溶出完全后，隨著提取時間增加，雜質溶出率也會相應增加，就會導致黃酮提取量降低，其次超聲加熱時間增長也有可能會導致黃酮結構被破壞，從而導致藜麥黃酮提取率降低［13］。

圖4 超聲時間對藜麥黃酮提取量的影響

2.3.3 負壓對藜麥黃酮提取量的影響 由圖5 可知，隨著提取壓力的降低藜麥黃酮提取量整體上呈先增加后減小的趨勢。當負壓低于0.05 MPa 時，藜麥黃酮提取量隨著負壓的增加而增大；當負壓達到0.05 MPa 時，藜麥黃酮提取量最大，為（5.29±0.061）mg/g；隨著負壓的進一步升高，藜麥黃酮的提取量也相應降低，可能的原因為隨著提取壓力降低，藜麥黃酮溶出后繼而有其他雜質的溶出，從而降低藜麥黃酮的提取量，此現象說明在其他條件相同的情況下，一定程度的減壓處理會促進黃酮類物質的溶出，由于在負壓的條件下，空氣相對稀薄，提取物受到的外力減?。?4-18］，細胞更容易張開破裂，使植物細胞中有效成分更容易析出。

圖5 負壓對藜麥黃酮提取量的影響

2.4 響應面試驗

利用Design-Expert 12.0 軟件中Box-Behnken 中心組合試驗設計，根據前期單因素試驗得出的最優條件為中心點，用響應面分析進行三水平三因素的優化試驗，試驗結果如表2 所示。以總黃酮提取量（Y）為響應值，回歸擬合，獲得藜麥黃酮提取量的回歸方程：

表2 響應面優化試驗結果

該模型的顯著性方差分析結果如表3 所示。該模型R2=0.997 9，調整后R2Adj=0.995 3。由回歸模型的方差分析F值可以推測出各因素的主效關系：固液比（B）＞負壓（C）＞超聲時間（A）。兩因素間交互作用對藜麥黃酮提取量的影響結果（響應面及等高線）如圖6 至圖8 所示，等高線曲線是響應面的投影。

圖6 超聲時間、固液比對總黃酮提取量的等高線及響應面

圖8 固液比、負壓對總黃酮提取量的等高線及響應面

表3 方差分析結果

兩兩因素間的交互作用對響應值影響水平可由等高線的形狀來確定。由圖6 至圖8 可知，超聲時間和固液比之間、超聲時間和負壓之間及負壓和固液比之間兩兩因素交互作用顯著。隨著每個因素的增大，響應值增大，當響應值增大到最大值后，隨著因素的增大，響應值逐漸減?。?9，20］。該模型有最大值，即綜合單因素試驗得到的最優條件得出最佳提取量。

藜麥黃酮最佳提取量及操作條件求算過程：將回歸方程求導，得到三元一次方程組。

求解得A=27.234，B=0.028，C=0.059，即該模型最優結果：超聲時間27 min、固液比1∶36 和負壓0.059 MPa，在此條件下獲得藜麥黃酮預測提取量為5.28 mg/g。優化后重復3 次試驗，獲得藜麥黃酮實際提取量為（5.31±0.038）mg/g，與預測值相近，證明該模型能準確可靠地預測藜麥黃酮的總提取量。

2.5 藜麥黃酮提取后粉末SEM 表征

脫脂藜麥粉末在超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W條件下，不同超聲時間、固液比和負壓提取條件下藜麥樣品的SEM 表征如圖9 所示。

圖9 藜麥粉末不同提取條件下的SEM 圖

樣品SEM 表征符號說明如表4 所示。由表4 可知，SEM 表征樣品各提取條件分別為“2.3”和“2.4”提取單因素試驗中每組的最優條件及響應面擬合優化得出最優條件，結合“2.3”和“2.4”的藜麥黃酮提取量可知藜麥細胞壁破損程度越大，藜麥黃酮提取量越大，細胞壁的破損程度依次為d＞c＞b＞a。對應藜麥黃酮的提取量分別為（5.31±0.038）mg/g ＞（5.29±0.061）mg/g＞（5.21±0.025）mg/g＞（4.75±0.062）mg/g。由此可知，藜麥細胞壁在超聲-負壓條件下破損最嚴重，更有利于藜麥黃酮溶入提取液中，從而提高了藜麥黃酮的提取量。

表4 樣品SEM 表征符號說明

2.6 純化藜麥黃酮體外抗氧化活性

2.6.1 純化藜麥黃酮總還原能力 由圖10 可知，在試驗溶液濃度范圍（0~0.25 mg/mL）內，純化藜麥黃酮的還原能力與溶液濃度呈正相關。純化藜麥黃酮的還原能力小于維生素C，在0.25 mg/mL 的濃度下，維生素C 的總還原能力約為純化藜麥黃酮的2.1 倍。

圖10 藜麥黃酮與維生素C 的總還原能力

2.6.2 純化藜麥黃酮對DPPH 自由基的清除作用由圖11 可知，純化藜麥黃酮對DPPH 自由基的清除能力與其濃度呈正相關。DPPH 自由基清除能力低于維生素C，在藜麥黃酮濃度達到0.25 mg/mL 時對DPPH 自由基的清除率（89.5±0.43）%接近于維生素C。

圖11 藜麥黃酮與維生素C 對DPPH 自由基的清除作用

3 結論

1）基于單因素（固液比、超聲時間和負壓）試驗，通過響應面法優化獲得藜麥黃酮超聲-負壓法提取最佳工藝參數為超聲時間27 min，固液比1∶36 和負壓0.059 MPa，該條件下藜麥黃酮提取量為（5.31±0.038）mg/g，與預測提取量5.28 mg/g 接近，根據響應面分析獲得各因素對藜麥黃酮提取量影響大小依次為固液比＞負壓＞超聲時間。藜麥黃酮提取量（Y）回歸方程為Y=-1.062 09+0.144 733A+9.488 99B+178.536 92C+0.240 37AB-0.023 915AC-237.169 05BC-0.002 659A2-79.605 11B2-1 760.253 85C2。該條件下可以有效提取藜麥黃酮，且提取條件容易實現。

2）純化藜麥黃酮具有良好的體外抗氧化活性，純化藜麥黃酮的抗氧化活性與其濃度呈正相關。