工業發酵對雪茄茄芯中性香氣成分的影響

潘 勇，李林林，方 欣，朱婷婷，周亞彬，胡 捷，王榮浩，劉 洋，譚再鈺，楊 梅，黃友誼，施友志

（1.湖北中煙工業有限責任公司，武漢 430040；2.華中農業大學，a.園藝林學學院；b.生命科學技術學院，武漢 430070）

煙葉發酵是改善雪茄煙葉品質的重要工序，將在田間成熟及晾制完成的基礎上進一步形成雪茄煙葉品質［1-3］。發酵處理使煙葉中的內含物質進一步分解和轉化，并使得煙葉內各種化學成分更加協調；同時能夠提高雪茄煙葉中性香氣物質的含量，降低煙葉雜氣和刺激性，獲得更好的香氣和吃味［4-8］。煙葉的工業發酵，又被稱為深度發酵或二次發酵［9］，主要目的是彌補初次發酵的不足，或提升煙葉的風格特征，讓煙葉成分更加協調，以提升煙葉的工業可用性［10，11］。目前在雪茄煙葉發酵方面的研究主要集中于初次發酵［8］，而對工業發酵方面的研究較少，尤其是工業發酵對雪茄香氣的影響。本研究以工業發酵過程中不同階段的雪茄茄芯為研究對象，分析發酵過程中茄芯中性香氣成分的種類及含量的變化，篩選發酵前后的主要差異物質，分析工業發酵對茄芯中性香氣成分的影響，為工業發酵提升茄芯煙葉品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料與試劑：試驗煙葉為從洪都拉斯進口的雪茄煙品種HABANO 生產的茄芯煙葉（已調制和初次發酵）。二氯甲烷、正構烷烴（C8~C40）、乙酸苯乙酯等，均為色譜純。

儀器與設備：同時蒸餾萃取裝置，賽克斯玻璃儀器有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；TRACE 1300+ISQ7000 氣質聯用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 煙葉發酵及取樣

雪茄茄芯的工業發酵按照湖北中煙三峽煙廠的生產技術標準要求進行操作，生產周期約4 個月（2019 年8 月23 日至12 月26 日）。在整個發酵過程中，由經驗豐富的熟練加工人員根據堆垛發酵情況，對堆垛進行翻堆處理，并根據發酵時間和翻堆情況，在原料（8 月23 日）、前期（9 月24 日）、中期（10 月29日）、后期（11 月22 日）及出堆（12 月26 日）5 個階段翻堆或出堆前按五點法取樣，樣品于-20 ℃保存。

1.3 中性香氣成分的提取

使用水蒸氣蒸餾-二氯甲烷溶劑萃取法（同時蒸餾萃取法）提取茄芯中性香氣成分。在1 L 圓底燒瓶中加入5.0 g 煙樣（過40 目篩）、0.5 g 檸檬酸、500 mL蒸餾水和50 μL 乙酸苯乙酯內標（2.226 μg/μL），使用恒溫電熱套進行加熱；裝置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷的250 mL 圓底燒瓶，該端燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱，水浴溫度為60 ℃，蒸餾萃取2.5 h。萃取完成后，加入過量無水硫酸鈉干燥有機相，將有機相轉移到茄形瓶，然后使用旋轉蒸發儀濃縮至1 mL 左右，即得煙葉精油，用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS 分析條件

色譜柱：TG-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。載氣：He，流速：1.0 mL/min。進樣口溫度為250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃。離子源溫度為177 ℃。升溫程序：初始溫度60 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min 的升溫速度升至230 ℃，保留15 min。分流比10∶1，進樣量為2 μL。電離能為70 eV，電離方式為EI。質量數范圍為35~500 amu，溶劑延遲6 min。由GC-MS得出正構烷烴標樣和發酵樣品中各香氣成分色譜峰的保留時間，計算物質的保留指數，經計算機通過NIST 譜庫進行檢索匹配，結合數據庫中的匹配度和保留指數進行定性。假定校正因子為1，采用內標法進行半定量分析。

1.5 數據分析

數據整理及基本圖表繪制使用軟件EXCEL2006、SPSS23.0、Origin2019 和聯川生物平臺（www.omicstudio.cn）中云工具進行分析與繪制。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中茄芯中性香氣成分的種類

為探究發酵對雪茄茄芯香氣品質的影響，采用同時蒸餾萃取結合GC-MS 方法檢測了雪茄茄芯不同發酵階段中的中性香氣成分，如表1 所示，從所有樣品中共檢測并鑒定出59 種中性香氣成分。根據香氣物質的結構，這些中性香氣成分分為酮類、醇類、醛類、酯類、烴類、含氮化合物、芳香烴類和酚類8 類，其中酮類18 種（31%）、醇類14 種（24%）、醛類7種（12%）、烴類6 種（10%）、含氮化合物5 種（8%）、芳香烴類4 種（7%）、酯類3 種（5%）、酚類2 種（3%）（圖1a），表明酮類、醇類是雪茄茄芯的主要中性香氣成分。如圖1b 所示，中性香氣成分種類數量在雪茄茄芯發酵過程的變化較小，有40 種中性香氣成分一直存在于發酵的所有階段，表明工業發酵對雪茄煙葉中性香氣成分的種類數量無明顯影響。

圖1 雪茄茄芯發酵過程中中性香氣成分的種類占比（a）和種類韋恩圖（b）

2.2 發酵過程中茄芯中性香氣成分的動態變化

使用聯川生物平臺（www.omicstudio.cn）中二維PCA 云工具對發酵不同階段的雪茄茄芯中性香氣成分進行主成分分析，對數據進行z-score 歸一化處理，以消除數值異常高的成分對后續分析的影響，減少數據間的“貧富差距”。如圖2a 所示，茄芯的原料、出堆樣品出現明顯分化，而發酵前期、中期和后期聚在一起，表明發酵過程中茄芯中性香氣成分的變化主要在原料和發酵前期之間，以及發酵后期和出堆之間，而發酵前期、中期和后期樣品中中性香氣成分的差異較小。發酵過程中雪茄茄芯中性香氣成分總量及不同類型的含量如圖2b 所示，中性香氣成分總量呈先減后增的變化趨勢，整體上發酵前后中性香氣成分總量增加明顯。不同種類中性香氣成分的含量變化中，醛類、酯類的含量在發酵過程無顯著性變化（P＞0.05），酚類、烴類的整體含量均呈顯著增加（P＜0.05）；其余種類物質的含量在發酵過程中變化顯著，但發酵前后的含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 發酵過程中茄芯中性香氣成分的變化趨勢

對雪茄茄芯深度發酵過程中中性香氣成分進行STEM 變化趨勢聚類分析，對數據進行預處理，以發酵原料為對照，計算所有樣本相對原料的含量倍數（Fold change，FC），并對含量倍數取Log2FC，預先設計4 種變化趨勢，變化跨度為2，將中性香氣成分分配給每個趨勢，結果如圖3 所示。由圖3 可知，發酵過程中茄芯中性香氣成分只有1 種模式，即先減后增型的變化趨勢顯著（P＜0.05），該模式變化下共有10 種中性香氣成分，包括茄酮、（2-trans，6-trans）-farnesal、新植二烯、植酮、8S，14-柏木二醇、法尼基丙酮、鄰苯二甲酸二丁酯、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當二烯-13-酮、香葉基芳樟醇、植物醇。其余3 種模式的變化趨勢不顯著（P＞0.05）。

圖3 雪茄茄芯發酵過程中中性香氣成分的STEM 變化趨勢聚類（a）和顯著性變化趨勢聚類（b）

2.4 發酵過程中茄芯的主要差異中性香氣成分

為了篩選出雪茄茄芯發酵過程中的主要差異中性香氣成分，以原料樣為對照，采用偏最小二乘法（PLS-DA）進行分析，結合獨立樣本T檢驗，以VIP＞1.0 和P＜0.05 為標準篩選發酵前后差異中性香氣成分，結果如表2 所示。由表2 可知，從發酵過程中共篩選出14 種主要差異中性香氣成分，包括酮類的茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當二烯-13-酮，醇類的8S，14-柏木二醇、柏木腦、香葉基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-異丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-環四烯-1-醇、植物醇；含氮化合物的3-乙酰基吡啶、2，3′-聯吡啶，以及烴類的新植二烯、西松烯。

表2 雪茄茄芯煙葉發酵過程中的主要差異中性香氣成分

3 討論

發酵是調制的延續，也是改善雪茄煙葉品質的重要工序之一，香氣是煙葉的重要評價指標［12，13］，煙葉中各類香氣物質及其含量與其香型等品質特點密切相關［14］。本研究結果表明，一定程度的發酵整體上能夠提高茄芯中性香氣成分的含量，這與時向東等［15］的研究結果相符，但變化趨勢有所不同；本研究中茄芯中性香氣成分整體呈先減后增趨勢，前、中期的香氣總量減少，這可能是由于二次發酵前期溫度上升較快，發酵溫度較高，中性香氣成分揮發速度過快，而香氣前體物質等經過初次發酵含量有所下降，香氣生成速度較慢所致。從工業發酵前后共篩選出14 種差異中性香氣成分，這些成分是以質體色素降解產物為主，包括植酮、法尼基丙酮、新植二烯、香葉基芳樟醇、植物醇等；而質體色素降解產物是煙葉中主要香氣成分之一，與煙葉感官品質關系密切［16］。此外，西柏烷類的茄酮，是煙草中含量最為豐富的中性香味成分之一，具有獨特的香味；棕色化反應產物的3-乙酰基吡啶、2，3′-聯吡啶等與烤香、烘焙香和堅果香等香味特征有關［17］，不同物質可能對感官質量的作用不同。工業發酵對雪茄茄芯原料具體感官品質的影響以及主要中性香氣成分的代謝途徑等還有待于進一步研究。

4 結論

在工業發酵過程中，雪茄茄芯中性香氣成分的種類整體呈增加趨勢，但變化較小；其中性香氣成分的含量呈先減后增趨勢，整體上含量明顯增加；主成分分析表明中性香氣成分在原料和發酵前期之間，以及發酵后期和出堆之間變化較大。共篩選出14種雪茄茄芯關鍵中性香氣成分，包括茄酮、（+）-香柏酮、植酮、法尼基丙酮、15，16-二去甲-8（17），11-賴百當二烯-13-酮、8S，14-柏木二醇、柏木腦、香葉基芳樟醇、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-異丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-環四烯-1-醇、植物醇、3-乙酰基吡啶、2，3′-聯吡啶、新植二烯和西松烯。