宏基因二代測序技術在肺部感染病原學檢測中應用的研究進展

李 俏, 蘇振中, 許璐璐, 張 捷

（1.吉林大學第二醫院呼吸與危重癥醫學科，吉林 長春 130041;2.蘇州大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，江蘇 蘇州 215000）

肺部感染是呼吸系統常見疾病之一，病原學檢查結果的準確與否直接決定肺部感染性疾病的臨床治療效果。傳統病原微生物檢測技術在臨床上應用較廣泛，例如血清學檢測、病原體培養和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR） 等，但是仍有較多缺陷，如檢測所用時間長、易受廣譜抗菌藥物影響和與引物不匹配的微生物檢測受限等。傳統病原微生物檢測技術的諸多缺陷使其應用受到限制，特別是對不常見的病原體和培養條件苛刻的致病菌，給肺部感染性疾病的精準診斷及治療帶來挑戰。

近年來第二代測序技術不斷發展，宏基因二代測 序 （metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術已應用于感染性疾病病原學檢測，如呼吸道感染、血液感染、關節腔感染、中樞神經系統感染和胃腸道感染等，能夠快速檢出致病病原體，指導靶向抗菌治療［1-4］。mNGS 技術有助于檢測傳統檢測方法難以檢出的致病菌，亦有助于提高新型病原體的檢測水平。mNGS 技術通過對從支氣管 肺 泡 灌 洗 液 （bronchoalveolar lavage fluid，BALF） 中提取的RNA 進行測序，從而迅速鑒定了新型冠狀病毒［5］，mNGS 技術現已較普遍應用于感染性疾病病原的檢測，如鉤端螺旋體［6］和鸚鵡熱衣原體［7］等。

mNGS 技術通過對病原體進行無假設、無偏倚和可定量的檢測［8］，實現了高效及準確的病原體檢測，在肺部感染性疾病中的應用價值也逐漸顯現，為肺部感染性疾病的精準診斷提供了新思路。目前mNGS 技術在國內外也廣泛應用于肺部感染性疾病病原體物種的鑒定和耐藥基因研究等。本文作者分析mNGS 技術在不同類型微生物所致肺部感染性疾病中的應用及其在肺部感染性疾病不同類型樣本中的應用，進一步探討mNGS 技術的優勢和面臨的挑戰，為其在肺部感染性疾病的精準診斷和治療中的應用提供依據。

1 mNGS 技術的發展和原理

1977 年，SANGER 等［9］采用鏈終止抑制劑進行DNA 測序（即為Sanger 測序法），開創了分子檢測的新方法，隨著對測序通量需求的增加，檢測技術和流程也得到了改進。2004 年，研究者［10］采用Sanger 技術完成了人類基因組檢測，基于對人類基因組計劃研究的需求，檢測技術不斷成熟，推動了二代測序技術的產生［8，11］。mNGS 技術是一種大規模多程序并行的測序過程，可利用基因組學研究樣本中微生物的組成對病原體進行無假設、無偏倚和可定量的檢測［1，8，12］。mNGS 技術原理包括合成法測序和連接法測序［8］，mNGS 技術分析檢測過程包括臨床樣品處理、文庫制備、測序和結果分析，最終結合臨床得出診斷。現使用的測序平臺有Illumina（中國）科學器材有限公司提供的一系列測 序 平 臺 （iSeq、 MiniSeq、 MiSeq、 HiSeq、NextSeq 和NovaSeq 平 臺）、美 國Thermo Fisher Scientific 公司提供的Ion Torrent 平臺、英國BGI 公司提供的BGISEQ 平臺、美國Oxford Nanopore Technologies 公司提供的便攜式測序儀（MinION、GridION 和 PromethION） 等［1］。 并 采 用 基 于“spike-in”的校準來確定總微生物負荷［13］、采用捕獲探針進行消減雜交、 基于核糖核酸酶（ribonuclease，RNase） 的去除方法以及靶向序列的CRISPR-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase 9）切割［1］等方法，盡量減少樣本中其他核酸（人類宿主核酸和定植菌核酸等）的影響，從而達到準確鑒別病原體的目的。

2 mNGS 技術在肺部感染性疾病中的應用

2.1 mNGS 在肺部感染性疾病不同類型病原微生物鑒定中的應用

2.1.1 細菌檢測 細菌是肺部感染性疾病最常見的病原體，目前臨床仍以培養法作為細菌鑒定的“金標準”，但是檢測的種類受限并且培養需時長。mNGS 對細菌檢測的總體檢測效能整體優于傳統檢測，且檢測用時短。相關研究［14-16］顯示：mNGS技術的檢測陽性率高于常規檢測，并對罕見菌有較高的診斷效能，如單核細胞增多性李斯特菌和痤瘡丙 酸 桿 菌 等［17-18］。研 究［19-21］顯 示：mNGS 技 術 和傳統病原檢測技術對常見病原細菌的檢測敏感度比較差異無統計學意義，但mNGS 技術對罕見菌和體外培養條件要求苛刻細菌的檢測效能明顯優于傳統病原檢測技術，可作為傳統病原檢測法的有效補充。

2.1.2 真菌檢測 在肺部感染性疾病的常見病原體中，真菌感染較細菌感染少。MIAO 等［19］研究顯示：mNGS 技術在檢測真菌方面較傳統檢測方法更具有優勢，GU 等［16］采用Illumina 測序對多種體液（胸腔積液、腹腔積液和尿液等） 行mNGS 技術檢測，結果顯示：與傳統病原學檢測比較，mNGS 技術對真菌檢測具有較高的靈敏度和特異度。LI 等［21］對肺組織標本進行mNGS 技術檢測結果顯示：mNGS 技術的應用提高了肺部侵襲性真菌感染的診斷效率，但也有研究［14，22］顯示：雖然mNGS 技術對于病原檢測的總體陽性率高于傳統檢測方法，但其在真菌檢測方面無明顯優勢，特別是對于曲霉菌，這可能是由于真菌細胞壁的存在增加了檢驗的難度［22］。隨著技術的進步和基因庫的完善，mNGS 技術的檢測效能優勢將會逐漸突顯。

2.1.3 結核/非結核分枝桿菌檢測 結核病是我國常見的傳染病之一，結核病的早期診斷有助于降低結核病的傳播風險和患者的死亡率［23］，mNGS 技術可作為結核病傳統病原檢測技術的有效補充，有助于提高結核病的早期診斷率。研究［19，21，24］顯示：mNGS技術對結核分枝桿菌復合體檢測效能較高。ZHOU 等［23］研 究 顯 示：在 結 核 菌 診 斷 方 面，mNGS 技術總體檢測效能不亞于基因Xpert 利福平耐 藥 量 核 酸 擴 增 （Xpert mycobacterium tuberculosis/rifampicin，Xpert MTB/RIF） 檢 測 技術，并且可以同時對并發感染的其他致病菌及耐藥基因進行檢測。SHI 等［25］研究顯示：mNGS 技術對肺結核的診斷靈敏度遠高于痰抗酸染色法，但與Xpert MTB/RIF 檢測和體外培養法比較差異無統計 學 意 義。ZHOU 等［23］研 究 顯 示：mNGS 檢 測 與Xpert MTB/RIF 檢測對活動性肺結核的診斷靈敏度比較差異無統計學意義（44%vs42%，P>0.05），但高于傳統方法（29%），上述研究結果的差異考慮與存在產生細胞外核酸較少的胞內菌有關，盡管mNGS 技術可以識別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，協助非結核分枝桿菌種類的鑒定［25］，但是由于結核分枝桿菌復合群內部同源性高，基因相似性很高，在覆蓋不足的情況下難以確定結核分枝桿菌復合群中的物種，因此在應用于結核分枝桿菌復合群特定種類的鑒定時可能會造成一定誤差［21］，如有必要，應進行靶向 PCR 法檢測以進一步識別特定的結核菌株［23］，mNGS 技術與Xpert MTB/RIF 檢測聯合應用可提高結核病的診斷效能［24］。mNGS技術在結核病的診斷中具有潛在優勢，隨著技術的進步和相關數據庫的建立，對特定結核菌株和耐藥基因的鑒定效能也將不斷提升。

2.1.4 病毒檢測 目前臨床使用的病毒檢測方法中，免疫學檢測和PCR 法檢測應用較多，但檢測需對病原體進行預判，限制了未知病毒的檢測。近年來，mNGS 技術在各系統中病毒檢測方面應用較多，MIAO 等［19］研究顯示：mNGS 技術在病毒檢測方面具有優勢。VANRIJN 等［26］對慢性阻塞性肺疾病急性加重期呼吸道病毒的研究顯示：mNGS技術診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值較高，鼻病毒在病毒病原體中的發病率最高，其次是流感病毒、冠狀病毒及副流感病毒。GUAN等［27］對疑似病毒性腦膜炎患者行mNGS 檢測，成功分離出皰疹病毒，并采用PCR 法加以驗證，證實了其準確性。SOMASEKAR 等［28］對204 例急性肝衰竭患者的血清樣本行mNGS 檢測，共檢測出8 例先前未被識別的病毒病原體感染。mNGS 技術還可以對未知病毒進行檢測［7］，同時檢測對抗病毒藥物的耐藥基因［29］，其已經為新型冠狀病毒的鑒定、突變菌株的監測和流行病學研究提供了思路［5］，并為新型冠狀病毒的疫苗設計、藥物發現和診斷開發提供了分子基礎［30］。

2.1.5 其他病原體 GU 等［7］發現：采用mNGS技術對未能明確病原體的肺部感染患者進行檢測時診斷出5 例鸚鵡熱衣原體肺炎患者。侯婕等［31］在診斷1 例發熱和呼吸困難的患者時，發現患者傳統培養和外斐試驗結果均呈陰性，最終采用mNGS技術檢測明確診斷患者患有恙蟲病立克次體肺炎。因此在傳統病原檢測診斷困難時，可以利用mNGS技術檢測快速和靈敏的特點，檢測潛在的致病病原體，其具有較大的臨床應用價值。

2.2 mNGS 技術在肺部感染性疾病不同臨床標本中的應用

2.2.1 痰液和支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）標本 痰液是臨床工作中常用的病原學檢測標本，但易受污染及上呼吸道致病菌干擾，且很難獲得深部下呼吸道標本，只有合格的痰標本才能用于痰培養，因此不是最佳標本［32］。痰標本聯合侵入性技術在全球下呼吸道感染監測項目中被接受［33］，BALF 受口腔菌群影響小，但難以采集最深部標本，BALF 可在內窺鏡下獲得，因此具有侵入性［34］，建議患者治療后，在影像學吸收欠佳且病情允許時，通過纖維支氣管鏡留 取BALF 標 本［35］，BALF 可 作 為 肺 部 感 染 患 者病原檢測的有效補充。

研究［36-37］顯示：采用BALF 進行病原學檢測可以提高診斷效能，指導臨床治療。XIE 等［14］研究顯示：采用mNGS 技術行痰液和BALF 病原學檢測的靈敏度均高于傳統培養。PENG 等［32］研究顯示：合格的痰標本和BALF 標本的培養結果及抗菌藥物靈敏度結果存在較大差異。BALF 可通過纖維支氣管鏡獲得，可以代表下呼吸道感染的狀態，BALF 在間質性肺炎、肺部感染和肺癌等多種肺部疾 病 的 診 斷 檢 查 中 發 揮 重 要 作 用［38］。CHEN 等［36］采用mNGS 技術對BALF 進行病原檢測，檢測陽性率為85%，優于傳統檢測。特別是在免疫功能缺陷患者的診斷中，mNGS 技術對于BALF 樣本的檢測具有潛在優勢，同時提高了重癥社區獲得性肺炎微生物的檢出率［37］。mNGS 技術對肺部真菌感染、寄生蟲感染、病毒感染和痰涂片/培養陰性的肺結核BALF 樣本具有較高的診斷價值，但其對于結核病的診斷尚存一定爭議，有研究［25］顯示：mNGS 技術和體外培養技術的檢測效能比較差異無統計學意義。BALF 不僅可以應用于肺部感染的診斷，而且可以幫助鑒別潛在惡性腫瘤導致的肺部病變和肺泡出血等［38］。

2.2.2 肺組織標本 肺組織的微生物培養和病理學檢查可以作為侵襲性真菌感染的輔助診斷，研究［21，39-40］顯示：mNGS 技術檢測患者肺部病原體時可以通過肺活檢組織進行，這種方法在檢測速度和靈敏度方面具有潛在優勢。LI 等［21］對肺活檢組織行mNGS 技術和傳統培養方法進行分析，結果顯示：mNGS 技術對細菌和真菌檢測的靈敏度分別為100.0% 和57.1%，特異度分別為76.5% 和61.5%。與組織病理學方法比較，mNGS 技術在真菌（特別是侵襲性真菌）和結核分枝桿菌復合群的評估中，特異度（100.0%和 94.1%）和陽性預測值（100.0%和75.0%）較高［21］。有學者［41］認為：目前關于肺部感染中對肺活檢組織標本采用mNGS技術的研究較少，與無細胞體液比較，組織標本中人類宿主核酸比例增加，使微生物核酸比例減少，可能導致mNGS 技術靈敏度降低，mNGS 技術可用于組織樣本的病原學檢查，但受宿主因素（背景核酸）的影響，現階段已有多項技術致力于減少宿主因素的干擾。

2.2.3 血液標本 血液系統屬于無菌微環境，血液系統感染可導致敗血癥甚至感染性休克的發生，這是住院患者死亡的重要原因之一。敗血癥不僅是重癥肺炎患者常見并發癥，同時也是導致重癥肺炎患者預后不良的重要危險因素，因此對于血液系統感染的檢測和早期診治十分重要［36］。研究［35］顯示：社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）患者并發菌血癥的概率為5%～25%，因此建議所有需住院治療的CAP 患者行血培養檢測。但傳統血培養易受抗生素使用的影響，并且檢測周期長，容易延誤病情，第二代測序技術檢測周期短，可以快速檢測血漿致病菌DNA 片段，并可對其耐藥性進行分析［42］。由于致病菌會隨著時間推移發生變化［43］，常規培養耗時長，可能會延誤病情，建議可在早期采用mNGS 技術對重癥CAP 患者行病原體檢測。

研究［4］顯示：健康人的血液中可檢測到細菌DNA，其分類組成與膿毒血癥不同，在膿毒癥患者中，需氧或微需氧微生物 （75.1%） 占主導地位，而健康志愿者的血液中以厭氧雙歧桿菌目的細菌DNA 為主（73.0%）。因此，雖然mNGS 技術可以快速且準確地檢測出病原體，并且已有較多的輔助技術區分定植菌，但在采用mNGS 技術對血液行病原學檢測時，仍需密切結合臨床資料對檢測結果進行綜合分析以確定致病菌。

2.2.4 其他臨床標本 mNGS 技術在其他標本中也有應用，目前已被應用于胸腔積液、腦脊液、膿液、間質液、骨髓、鼻拭子、關節液、超聲處理液和尿液等標本的病原學檢測［39，44-45］，但相關研究尚較少。WANG 等［44］研究顯示：mNGS 技術提高了皮膚和軟組織感染病原檢測的敏感性，但在組織、膿液、拭子和間質液各樣本中檢測陽性率比較差異無統計學意義。HUANG 等［45］采用mNGS 技術對關節液、超聲處理液和組織標本對骨關節感染進行診斷時發現：mNGS技術總體陽性率高于傳統檢測，并且在關節液和超聲處理液中mNGS 技術總體陽性率亦高于傳統培養。

3 mNGS 技術在耐藥性分析中的應用

我國是抗生素消耗量最大的國家之一，抗生素的過度使用會導致耐藥菌和耐藥基因的產生，給臨床治療帶來一定難度，成為公共衛生領域的挑戰之一［43］。了解抗生素耐藥基因譜與抗菌藥物結果之間的相關性，建立公共抗生素耐藥基因數據庫將有助于個體化抗感染方案的實施。近年來，研究［42］證明：基于mNGS 技術診斷可以快速檢測不同致病菌抗生素耐藥基因及毒力因子，發現了許多種類的抗生素耐藥基因，較傳統藥敏檢測節約了大量時間，特別是傳代周期長的微生物，如結核分枝桿菌。但由于缺乏傳統耐藥檢測的驗證，mNGS 技術在耐藥性檢測方面仍存在挑戰，在準確性（需要穩健的質量控制）和耐藥表型-基因型相關性方面仍然存在局限性，無法準確判定病原體對抗生素的耐藥性［37］。技術層面，mNGS 技術可以快速檢測耐藥基因型，從而預測抗生素耐藥表型，但其在耐藥表型-基因型相關性檢測方面仍然存在局限性［33］。因此，耐藥表型和基因型方法互補，需協同檢測以提高檢測的靈敏度和特異度。

4 mNGS 技術在臨床應用中的不足之處

雖然mNGS 技術有較高診斷效能，但仍存在一定的不足：①盡管已采用多種方法去除人類背景DNA/RNA，人類宿主核酸背景仍然會影響樣本中的微生物核酸；②在取樣、送檢和檢測過程中，均存在微生物污染可能，需要嚴格遵守操作流程的質量控制程序，以保持無菌和無核酸的測試環境［1，23］；③樣本中微生物的濃度低于正常檢測線或病原微生物未在檢測范圍會出現假陰性結果；④受病原體基因庫的影響，對新物種的檢測有一定限制；⑤對胞內菌、RNA 病毒和有細胞壁的病原體檢測相對受限；⑥缺乏統一的報告解讀標準［13］，需結合臨床資料進行解讀；⑦能對耐藥基因進行檢測，但無法準確判定病原體對抗生素的耐藥性［37］。

5 結語和展望

肺部感染性疾病仍是臨床工作的一大重點，mNGS 技術因其檢測效率高、檢測周期短、受抗生素應用的影響小及檢測致病菌廣泛等優點，已從實驗室檢測逐步應用于臨床檢測，指導臨床用藥，但仍存在一定局限性，建議將mNGS 技術作為傳統病原學檢測技術的補充，并深入探討其臨床應用價值，實現感染性疾病的精準診斷和治療。