睪酮在體外對人卵巢顆粒細胞SVOG 凋亡的影響及其內質網(wǎng)應激機制

仝曉麗, 范明慧, 孟 嬌, 朱繼紅，盛敏佳

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，吉林 長春 130033；2.山西省臨汾市中心醫(yī)院生殖健康與不孕不育科，山西 臨汾 041000；3.吉林大學第一醫(yī)院生殖醫(yī)學?產(chǎn)前診斷中心,吉林 長春 130021）

我國育齡期婦女中多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 患病率約為5.6%［1］，高雄激素血癥是其重要臨床表現(xiàn)。既往研究［2-4］顯示：PCOS 患者卵巢顆粒細胞出現(xiàn)異常凋亡，而顆粒細胞凋亡是引起卵泡閉鎖的基礎機制。研究［5-7］顯示：內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 發(fā)生在卵巢細胞中，影響卵母細胞的成熟、卵泡的形成和排卵過程。經(jīng)典凋亡途徑包括外源性（死亡受體）途徑和內源性（線粒體）途徑，而ERS 所介導的細胞凋亡途徑是不同于前兩者新的信號傳導通路［4］。ERS 導致多個信號傳導級聯(lián)的激活，統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應（upfolded protein response，UPR），在應激過程中起主要作用，并影響多種細胞功能。轉錄因子C/EBP 同 源 蛋 白 （C/EBP homologous protein，CHOP） 與其他UPR 相關基因可在內質網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）協(xié)同作用下參與細胞死 亡。死 亡 受 體5 （death receptor 5， DR5） 是CHOP 的轉錄靶點，在ERS 誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用［4，8］。研究［9-11］顯示：ERS 在卵泡顆粒細胞后期被激活，且PCOS 組患者中ERS 激活程度高于非PCOS 組。ERS 參與雄激素誘導的其他類型細胞凋亡，包括前列腺癌細胞［12］、胰島β 細胞［13］和胚胎干細胞［14］，推測ERS 是由睪酮在竇卵泡顆粒細胞中激活，并通過誘導CHOP 蛋白及其轉錄靶點DR5 的激活促進細胞凋亡。本研究探討睪酮對體外培養(yǎng)的SVOG 細胞中ERS 活化的影響和睪酮誘導SVOG 細胞凋亡過程中CHOP-DR5 通路的作用，采用實時熒光定量PCR （real-time quantitative PCR，RT-qPCR） 法觀察ESR 激活的標志物剪切型X-盒結合蛋白1 （sliced X-boxbinding protein 1， XBP1s）、 激 活 轉 錄 因 子4（activating transcription factor 4，ATF4）、CHOP和DR5 在經(jīng)睪酮誘導的SVOG 細胞中的表達，研究睪酮聯(lián)合ERS 抑制劑牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDCA）和雄激素受體（androgen receptor， AR） 抑 制 劑 氟 他 胺 對SVOG 細胞凋亡的作用及其對CHOP 和DR5 基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器人卵巢顆粒細胞SVOG（美國ATCC 細胞庫）。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國Gibco 公司），睪酮（貨號A050109，上海薩恩化學技術有限公司），氟他胺（貨號HY-B0022） 和TUDCA （貨 號HY-19696， 美 國MCE 公 司），Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）， RNase free H2O、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Mix（瑞士Roche 公司），實時熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）引物［生工生物工程（上海）有限公司］。CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司），倒置相差顯微鏡（美國Olympus 公司），低溫高速離心機（美國Berkman 公司），Epoch 微孔板酶標儀（美國伯騰公司），RT-qPCR 儀（德國Roche Light Cycler 公司），迷你離心機（海門市其林貝爾儀器），流式細胞儀（美國BD 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)將復蘇的SVOG 細胞采用RPMI-1640 復合培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗）置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換液1 次，細胞融合度達90%時采用0.25%含EDTA 的胰酶消化貼壁的SOVG 細胞，待細胞生長至對數(shù)生長期用于實驗研究。

1.3 細胞形態(tài)表現(xiàn)取對數(shù)生長期的SVOG 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細胞，培養(yǎng)12 h 后，加入藥物后分別培養(yǎng)24 和48 h，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況。

1.4 最佳藥物作用濃度篩選和MTT 法檢測SVOG 細胞增殖抑制率取對數(shù)生長期SVOG 細胞，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種5×103個細胞，培養(yǎng)12 h 后，加入睪酮，分別培養(yǎng)24 和48 h，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況；每孔加入20 μL 0.5% 噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，去除培養(yǎng)基后加 入150 μL 二 甲 基 亞 砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃恒溫振蕩箱震蕩10 min，于酶標儀490 nm 波長處檢測各細胞孔的吸光度（A）值，計算細胞增殖抑制率， 細胞增殖抑制率=［1－（實驗組平均A 值/對照組平均A 值）］×100%，篩選出睪酮最佳作用濃度。將SVOG 細胞加入不同濃度（0.1×10－5、0.5×10－5、1.0×10－5、5.0×10－5和10.0×10－5mol·L－1）氟他胺和不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 g·L－1）TUDCA 后培養(yǎng)24 h后，再加入睪酮（1.0×10－5mol·L－1），分別培養(yǎng)24 和48 h，顯微鏡觀察細胞生長情況，MTT 法計算細胞增殖抑制率，篩選氟他胺和TUDCA 的最佳作用濃度。

1.5 流式細胞術檢測SVOG 細胞凋亡率96 孔細胞培養(yǎng)板中按5×105mL－1濃度鋪板，細胞貼壁生長12 h 后，更換含相應藥物的培養(yǎng)基 200 μL（實驗組分別采用1.5 g·L－1TUDCA 及1.0×10－5mol·L－1氟他胺培養(yǎng)24 h，再采用1.0×10－5mol·L－1睪酮培養(yǎng)24 h）。48 h 后，采用1～2 mL 胰酶消化細胞收集。 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌細胞2 次，收集5×104個細胞，195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結合液重懸細胞，先加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 混 勻 后，加 入10 μL 碘 化 丙 啶（propidum iodide，PI）染色液混勻，避光、室溫反應20 min， Annexin Ⅴ-/PI 染色法檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6 RT-qPCR 法 檢 測SVOG 細 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表 達 水 平將SVOG細胞分為對照組、睪酮組（1.0×10－5mol·L－1睪酮）、睪酮+氟他胺組（1.0×10－5mol·L－1睪酮+1.0×10－5mol·L－1氟 他 胺） 和 睪 酮+TUDCA 組（1.0×10－5mol·L－1睪 酮+1.5 g·L－1TUDCA），培養(yǎng)0、3、24 和48 h 后采用RT-qPCR 法檢測各組細 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達水平，TRIzol 法提取各組細胞總RNA，測定RNA 濃度和A（260）/A（280）比值。逆轉錄合成cDNA，反應總體積為 20 μL，反應條件：95 ℃預變性 10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40 個循環(huán)。 引物序列： XBP1s 上游引物5'-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3'，XBP1s 下 游 引 物5'-TGCTGAGTCCGCAGCAGGTG-3'；ATF4 上游引物5' -GGCTGGCTGTGGATGGGTTG-3'，ATF4 下游引物5'-CTCCTGGACTAGGGGGGCAA-3'；CHOP 上 游 引 物5'-GGAGAACCAGGAAACGGAAAC-3'， CHOP 下 游 引 物5' -TCTCCTTCATGCGCTGCTTT-3'；DR5 上 游 引 物5'-CCAGCAAATGAAGGTGATCC-3'，DR5 下 游引 物5' -GCACCAAGTCTGCAAAGTCA-3'； 采用 2－△△Ct法計算目的基因mRNA 表達水平。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組SVOG 細胞增殖抑制率，細胞凋亡率，各組細胞中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組SVOG 細胞形態(tài)表現(xiàn)倒置相差顯微鏡下觀察SVOG 細胞形態(tài)表現(xiàn)：對照組SVOG 細胞呈橢圓形，以貼壁方式生長，細胞之間連接緊密，邊界清晰，透光性好；睪酮組SVOG 細胞中，存活細胞數(shù)減少，異型細胞增多，細胞邊緣模糊，細胞體內有明顯顆粒感，培養(yǎng)基中細胞碎片增多，透光性差，上述現(xiàn)象隨著睪酮濃度的增加更加明顯；與對照組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組SVOG 細胞上述改變仍存在；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組SVOG 細胞上述改變明顯減輕。

2.2 最佳藥物作用濃度篩選結果不同濃度睪酮對SVOG 細胞生長均有抑制作用，呈劑量依賴性，當睪酮濃度為5.0×10－5mol·L－1時，48 h 后細胞增殖抑制率達到70.77%，本研究選取選睪酮濃度為1.0×10－5mol·L－1。各組細胞分別加入不同濃度氟他胺和TUDCA 后培養(yǎng)12 和24 h，再加入睪酮（1.0×10－5mol·L－1） 培 養(yǎng)24 和48 h，與 睪 酮 組（1.0×10－5mol·L－1）比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA 組細胞生長受到抑制，當氟他胺濃度為1.0×10－5mol·L－1且TUDCA 濃度為1.5 g·L－1時拮抗效果最佳。

2.3 不同濃度睪酮作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率MTT 比色法檢測結果顯示：相同濃度睪酮作用下，與24 h 比較，48 h 時SVOG 細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；作用相同時間，不同濃度睪酮作用SVOG 細胞后，細胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同濃度睪酮作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with different concentration of testosterone for different time（±s，η/%）

表1 不同濃度睪酮作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with different concentration of testosterone for different time（±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 mol·L－1 testosterone;#P<0.05 vs 0.5×10－5 mol·L－1 testosterone;○P<0.05 vs 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone;▲P<0.05 vs 5.0×10－5 mol·L－1 testosterone.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 mol·L－1 testosterone 1.08±1.15 10.75±1.87*0.1×10－5 mol·L－1 testosterone 2.04±1.48 19.15±0.37*0.5×10－5 mol·L－1 testosterone 10.98±2.24△32.19±1.63*△1.0×10－5 mol·L－1 testosterone 30.07±0.80△#45.91±2.17*△#5.0×10－5 mol·L－1 testosterone 43.64±5.55△#○70.77±2.42*△#○10.0×10－5 mol·L－1 testosterone 50.10±6.68△#○▲75.85±2.38*△#▲

2.4 睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用后SVOG 細胞增殖抑制率MTT 比色法檢測結果顯示：與作用24 h 比較，相同濃度（1.0×10－5mol·L－1）睪酮+氟他胺作用48 h 時SVOG 細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；作用相同時間后，睪酮+不同濃度氟他胺作用對SVOG 細胞增殖抑制率比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.2 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone combined with different concentrations of flutamide for different time （±s，η/%）

表2 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度氟他胺作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.2 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with 1.0×10－5 mol·L－1 testosterone combined with different concentrations of flutamide for different time （±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 mol·L－1 flutamide;#P<0.05 vs 0.5×10－5 mol·L－1 flutamide;○P<0.05 vs 1.0×10－5 mol·L－1 flutamide;▲P<0.05 vs 5.0×10－5 mol·L－1 flutamide.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 mol·L－1 flutamide 35.31±0.77 47.15±2.69*0.1×10－5 mol·L－1 flutamide 33.36±8.39 45.91±2.17*0.5×10－5 mol·L－1 flutamide 18.67±1.63△33.68±3.86*△1.0×10－5 mol·L－1 flutamide 13.32±0.87△#21.99±1.51*△#5.0×10－5 mol·L－1 flutamide 21.04±0.37△#○36.15±4.11*△#○10.0×10－5 mol·L－1 flutamide 26.05±2.70△#○▲49.89±4.09*△#○▲

2.5 睪酮聯(lián)合TUDCA 作用后SVOG 細胞增殖抑制率MTT 比色法檢測結果顯示：與作用24 h 比較， 相 同 濃 度 （1.0×10－5mol·L－1） 睪 酮+TUDCA 作用48 h 后SVOG 細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；作用相同時間后，睪酮+不同濃度TUDCA 作用對SVOG 細胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度TUDCA 作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.3 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with testosterone combined with different concentrations of TUDCA for different time （±s，η/%）

表3 1.0×10－5 mol·L－1睪酮聯(lián)合不同濃度TUDCA 作用不同時間后SVOG 細胞增殖抑制率Tab.3 Inhibitory rates of proliferation of SVOG cells after treated with testosterone combined with different concentrations of TUDCA for different time （±s，η/%）

*P<0.05 vs 24 h;△P<0.05 vs 0 g·L－1 TUDCA;#P<0.05 vs 0.5 g·L－1 TUDCA;○P<0.05 vs 1.0 g·L－1 TUDCA;▲P<0.05 vs 1.5 g·L－1 TUDCA;●P<0.05 vs 2.5 g·L－1 TUDCA.

Inhibitory rate of proliferation Group 24 h 48 h 0 g·L－1 TUDCA 38.50±5.43 46.91±1.03*0.5 g·L－1 TUDCA 27.07±5.47△40.08±3.62*△1.0 g·L－1 TUDCA 21.03±4.09△#32.49±5.15*△#1.5 g·L－1 TUDCA 11.22±1.47△#○19.95±1.19*△#○2.5 g·L－1 TUDCA 21.17±4.35△▲39.43±1.05*#▲5.0 g·L－1 TUDCA 35.78±5.37▲●43.98±5.31*▲●

2.6 各組SVOG 細胞凋亡率Annexin Ⅴ-FITC/PI 法和流式細胞術檢測細胞凋亡情況，結果顯示：與對照組（2.73%±0.14%）比較，作用48 h 后，睪 酮 組（1.0×10－5mol·L－1） SVOG 細 胞 凋 亡 率（53.88%±1.38%） 升高（P<0.05）；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組（14.94%±0.75%）和睪酮+TUDCA 組（40.07%±1.08%） SVOG 細胞凋亡率降低（P<0.05）。見圖1。

圖1 作用48 h 后各組SVOG 細胞凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of SVOG cells after treated for 48 h

2.7 各 組SVOG 細 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達水平作用48 h 后，與對照組比較，睪酮組SVOG 細胞中XBP1s、ATF4、CHOP和DR5 mRNA 表達水平均明顯升高（P<0.05）；與睪酮組比較，睪酮+氟他胺組和睪酮+TUDCA組SVOG 細 胞 中XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達水平降低（P<0.05）。見圖2。

圖2 作 用48 h 后 各 組SVOG 細 胞XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表 達 水 平Fig.2 Expression levels of XBP1s, ATF4, CHOP,and DR5 mRNA in SVOG cells in various groups after treated for 48 h

3 討 論

PCOS 是一種與代謝和內分泌異常相關的綜合征，高雄激素血癥是其關鍵特征之一［15］。目前認為引起PCOS 患者排卵障礙及內分泌改變的病理基礎為原發(fā)性和內在性卵泡生長異常，而顆粒細胞的凋亡是卵泡發(fā)育異常的主要誘因［2］。除了死亡受體途徑和線粒體途徑外，ERS 啟動的凋亡途徑亦參與顆粒細胞的凋亡［16］。ER 是體內合成蛋白質的場所，參與體內多種代謝［17］，在調節(jié)細胞內穩(wěn)態(tài)中起重要作用［18-19］。當受到外在或內源性刺激時，其功能紊亂會使未折疊或錯誤折疊的蛋白在ER 中聚集，激發(fā)ERS，最終誘導細胞凋亡［20］。本研究結果顯示：睪酮處理后，SVOG 細胞形態(tài)發(fā)生改變，異型細胞增多，胞質中出現(xiàn)較多顆粒，培養(yǎng)基中細胞碎片增多，細胞增殖抑制率和細胞凋亡率增加，而AR 拮抗劑氟他胺和ESR 拮抗劑TUDCA 均可拮抗睪酮誘導的SVOG 細胞凋亡；睪酮可上調SVOG 細胞中UPR 基因XBP1s、ATF4、CHOP 和DR5 mRNA 表達水平。上述結果表明：睪酮在體外通過與AR 結合，激活CHOP-DR5 通路，誘導ERS，促進SVOG 細胞凋亡。既往研究［5-7］顯示：ERS 發(fā)生在卵巢細胞中，影響卵母細胞成熟、卵泡形成和排卵過程。小鼠體內實驗研究［21］顯示：ERS 會損害蛋白質分泌、線粒體活性和卵母細胞發(fā)育能力。PCOS 小鼠模型中，雙氫睪酮可在顆粒細胞和卵丘復合物中激活ERS，但在卵母細胞中并不能激活ERS［22］，高雄激素血癥導致卵丘細胞功能障礙，間接損害了PCOS 患者的卵母細胞能力。本研究結果顯示：睪酮處理后SVOG 細胞中CHOP 和DR5 mRNA 表達水平升高，表明睪酮誘導的SVOG 細胞凋亡可能是通過CHOP-DR5 途徑實現(xiàn)的，但是否存在除CHOP 外的UPR 基因參與誘導顆粒細胞凋亡，以及是否存在睪酮誘導的CHOP 能夠激活內在通路尚未確定，還需進一步研究。本研究采用TUDCA 并未完全逆轉睪酮誘導的CHOP 和DR5 mRNA 表達水平升高，其原因可能是研究中檢測ERS 相關基因時TUDCA 使用濃度不足。研究［9］顯示：顆粒細胞中ERS 激活情況依賴于卵泡發(fā)育時期，其僅在竇卵泡期的顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)。故本研究采用的SVOG 細胞在一定程度上不能完全反映卵泡不同發(fā)育時期的顆粒細胞特征，具有局限性。

ERS 在機體內廣泛存在，通過調整蛋白質折疊功能，參與調控機體各項病理生理變化，包括炎癥和葡萄糖毒性損傷［23-24］。PCOS 病理特征除高雄激素血癥外，還包括胰島素抵抗和慢性炎癥，均有可能通過誘導內源性雄激素產(chǎn)生，間接激活ERS［25］。研 究［26］顯 示：PCOS 患 者 卵 巢 組 織 中CHOP 和DR5 表達上調不僅出現(xiàn)在顆粒細胞中，在卵泡膜細胞中也可檢測到。由于卵巢組織中雄激素合成主要發(fā)生在卵泡膜細胞中，需進一步研究確定卵泡膜細胞中的ERS 情況，可能為PCOS 發(fā)病機制探索提供新的思路。另有研究［10］顯示：ERS抑制劑可有效降低顆粒細胞凋亡率，減少PCOS 卵巢間質纖維化，但并不能改善發(fā)情期和減少卵巢內囊泡數(shù)量。但目前尚無一種PCOS 動物模型可以完全模擬其病理變化，未來可能需要研究一種新型PCOS 動物模型，在不誘導類固醇合成的情況下自然發(fā)展為PCOS 表型，以研究下調ERS 是否有助于改善代謝特征以及卵巢病理，最終改善或治療PCOS。

綜上所述，睪酮可誘導人卵巢顆粒細胞凋亡，并引起卵泡閉鎖，其作用機制可能是雄激素與AR 結合激活CHOP-DR5 通路，誘導ERS 發(fā)生，促進顆粒細胞凋亡。該研究結果可能為PCOS 的診療提供新的研究思路和藥物治療靶點。