基于雜合肽H5LL 活性的生物信息學分析和重組乳酸菌表達載體的構建

趙瀟穎, 宿建勝, 馬嘉輝, 王岳峰, 王 丹, 孫麗媛

（北華大學醫學技術學院臨床生化及分子生物學檢驗教研室，吉林 吉林 132013）

抗 菌 肽（antimicrobialpeptides，AMPs） 又 稱抗微生物肽，廣泛分布于動物、植物和昆蟲界［1］，是具有抑菌、抗病毒和免疫調節活性的小型陽離子雙親肽［2］，因種類多、廣譜抗菌和不易誘導耐藥菌株產生等優點，近年來被稱為最具前景的抗生素替代品［3］。人源性AMPs 具有低排異反應和低毒性［4］，在臨床用藥和食品生產等方面有相對優勢。其中人源性AMPs重組蛋白5（histatin 5，Hst5） 是唾液腺和腮腺等分泌的富組蛋白家族成員之一，能有效殺滅口腔中致病的白假絲酵母菌［5-6］，DU 等［7］發現 Hst5 或其衍生物對六大超級細菌（ESKAPE），即屎腸球菌（Enterococcus faecium，E）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，K）、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，A）、銅綠假單胞 菌（Pseudomonas aeruginosa， P） 和 腸 桿 菌（Enterobacteria，E），感染的病原體也有抑菌效果。AMPs 產物LL-37［8］廣泛存在于皮膚、眼表和腸道等上皮細胞中，抗菌譜廣，具有抗感染和參與免疫調節等功能活性［9］。天然資源中提取AMPs 成本高且純度低，且提取的AMPs 具有細胞毒性和低穩定性等缺點［10-11］，限制其應用。故實現AMPs 高效、高產和安全性規模化生產，成為研究熱點。

為提高AMPs 的穩定性和抗菌活性，本研究以人源性AMPs Hst5 和LL-37 為親本，采用生物信息學工具設計并合成雜合肽H5LL 進行預測、分析其穩定性、抑菌機制和抑菌活性等相關內容。為解決AMPs 來源受限、生產成本高、不穩定和純化復雜等問題，目前基因工程是獲取AMPs 的最佳途徑。原核表達系統的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是人類和大多數動物腸道內益生菌，是公認安全的微生物［12-13］，廣泛應用于食品加工、農業及醫藥等領域。因此，在人源性雜合肽H5LL 基礎上，采用基因工程技術，以LAB 為宿主，組成型質粒pMG36e 為載體，構建重組分泌型表達載體，為后續雜合肽H5LL 的異源性表達研究提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 雜合肽、主要試劑和儀器

含雜合肽H5LL 目的序列的質粒pUC57-H5LL由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，大腸埃希菌（ATCC 43889）（中國科學院微生物研究所提供），pMG36e 質粒（武漢淼靈生物科技公司），大腸埃希菌感受態DH5α（上海生工生物工程公司提供）。HindⅢ內切酶、KpnⅠ內切酶和T4 DNA 連接酶（日本TaKaRa 公司），質粒小提試劑盒和凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司），紅霉素（上海源葉生物科技有限公司），LB 培養基（英國OXOID 生物公司）。NanoDrop One 微量核酸蛋白測定儀（美國Quawell 公司），金屬浴（美國科路森有限公司），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司），恒溫培養箱（上海博訊實驗有限公司）。

1.2 雜合肽H5LL 的設計

在NCBI 中 下 載Hst5 （NG_012279.1） 和LL-37（NG_012279.1）基因序列，采用抗菌肽集合數據庫CAMPR4 中的序列分析工具，預測親本肽的抗菌區域，將高抑菌活性肽段進行雜合，命名為H5LL。 參照乳酸菌密碼子偏愛性網站（http：//www.jcat.de）， 將H5LL 逆 向 轉 碼 為DNA 序列，同時雜合肽序列中添加HindⅢ和KpnⅠ酶切位點及組氨酸標簽。

1.3 雜合肽H5LL 生物信息學活性預測

1.3.1 H5LL 成肽可能性預測 采用抗菌肽集合數據庫CAMPR3［14］預測多肽H5LL 成為抗菌肽的可能性和抑菌區域。

1.3.2 H5LL 理化性質預測 采用抗菌肽生物信息學分析網站Expasy （https：// web.expasy.org/）中的Prot Param 進行雜合肽H5LL 理化性質預測［15］。預測參數包括相對分子質量、原子組成、凈電荷、半衰期、不穩定指數、親水性指數和脂肪指數等。

1.3.3 H5LL 疏水性預測 采用生物信息學在線網站Expasy 中的Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/） 和DNAStar 數 據 庫 中 的Protean 軟件預測雜合肽的疏水性。

1.3.4 H5LL 酶切位點預測 采用在線網站ExPASy （https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）中PeptideCutter 軟件預測各胰蛋白酶及其他酶類作用于H5LL 的潛在剪切位點。

1.3.5 H5LL 磷酸化位點和糖基化位點預測 蛋白質磷酸化和糖基化是真核生物重要且研究廣泛的翻譯后修飾，參與調控生物體的生命活動，前者主要發生在蘇氨酸、酪氨酸及絲氨酸殘基上［16］。分別采用在線軟件NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 和NetNGlyc 1.0 Server （https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc-1.0）預測雜合肽磷酸化及糖基化位點。

1.3.6 H5LL 跨膜區域預測 跨膜區域在細胞中提供識別和信號傳導等方面的作用，通常為α-螺旋結構［17］，可在細胞中行使轉運通道和信號傳導的功能。存在跨膜區域的抗菌肽，在胞內存在作用靶點，通過膜作用機制發揮活性。預測雜合肽的跨膜區域能夠對后續異源性表達研究提供依據，同時也可以更好地分析雜合肽H5LL 的抑菌機制。

1.3.7 H5LL 信號肽預測 在信號肽的作用下，多肽鏈進入內質網腔合成蛋白質，最終由細胞膜分泌到胞外，而信號肽在通過膜時由存在膜上的肽酶切除。采用生物學在線網站SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ SignalP-5.0）預測雜合肽H5LL 的信號肽。

1.3.8 H5LL 亞細胞定位預測 基因表達產物或蛋白質在細胞中的存在位置即亞細胞定位，可存在于如細胞核、細胞質、線粒體、內質網和高爾基體等部位。 通過在線網站 TargetP-1.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TargetP-1.1）對H5LL 的亞細胞定位的預測分析，有助于初步判斷和了解AMPs 的功能活性。

1.3.9 H5LL 二級結構預測 采用生物網站Expasy 中的SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和DNA star 數據庫中的Protean 軟件分別進行H5LL 二級結構預測。

1.3.10 H5LL 三級結構預測 采用在線網站SWISS-MODEL （https：//swissmodel.expasy.org/interactive） 和Phyre（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）在線預測H5LL 的三級結構。

1.4 重組乳酸菌表達載體的構建

1.4.1 目的基因和空載質粒的雙酶切及回收 根據質粒的HindⅢ和KpnⅠ限制性內切酶位點，建立pUC57-H5LL 和pMG36e 質粒的雙酶切體系。見表1。

表1 pUC57-H5LL 和pMG36e 質粒的酶切體系Tab.1 Digestion systems of pUC57-H5LL and pMG36e plasmids

酶切條件：37 ℃金屬浴2 h 后加入10×loading buffer 4 μL 終止反應。酶切產物電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳，130 V、35～40 min。目的片段凝膠回收：分別回收pUC57-H5LL 質粒目的小片段H5LL和pMG36e 酶切后的空載大片段DNA。

1.4.2 重組載體構建 根據T4 DNA 連接酶建立反應體系：H5LL 2.0 μL，pMG36e DNA 1.8 μL，T4 DNA Ligase 1.0 μL， 10×T4 DNA Ligation buffer 1.0 μL，滅菌ddH2O 補足至10.0 μL；充分混勻后0.5 mL Ep 管密封后低速瞬時離心，16 ℃金屬浴過夜連接。重組質粒命名為pMG36e-H5LL。

1.4.3 乳酸菌重組載體的驗證 將上述連接產物轉化至大腸埃希菌感受態細胞DH5α 中，涂布于LB 平板。挑選平板上數個單個菌落，TIANGEN質粒小提試劑盒提取質粒。設計目的基因H5LL 的引物，正向H5LL-F：5'-AAGCTTCATCATCATC-3'，反向H5LL-R：5'-GGTACCAAGGTTACGAAGG-3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 篩選陽性菌落：采用普通PCR 20 μL反應體系進行擴增，最適反應體系組成：DNA 模板1.0 μL，PCR Mastermix 12.5 μ L，上 游 引 物1.0 μL，下 游 引 物1.0 μ L， 無 菌ddH2O 補 至25.0 μL。最適反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行30 個循環，最后72 ℃充分延伸10 min。取5 μL PCR 產物，置于1.0%瓊脂糖凝膠中，調節電泳儀電壓至130 V，電泳35 min 后采用凝膠成像分析儀觀察。

根據PCR 法檢測結果，選取疑似陽性菌落質粒雙酶切，反應體系：陽性質粒20.6 μL，10×M buffer 4.0 μL，HindⅢ 2.0 μL，KpnⅠ 2.0 μL，滅菌ddH2O 補足至40.0 μL；后進行瓊脂糖凝膠電泳。

2 結 果

2.1 雜合肽H5LL 的構建AMPs Hst5 和LL-37肽段的抑菌區域最高預測值分別為0.95 和0.97。見表2。

表2 AMPs 抑菌區域預測結果Tab.2 Prediction results of antibacterial region of AMPs

根據預測結果并結合親本肽序列分析，選取Hst5 成熟肽段4～24 位氨基酸及LL-37 主要起抗菌作用的17～31 位氨基酸序列作為母本進行雜合，雜合肽H5LL 氨基酸序列為AKRHHGYKRKFHEKHHSHRGYFKRIVQRIKDFLRNL， 修 飾后基因序列為5'-AAGCTTCATCATCATCATCATCACGCTAAGCGTCACCACGGTTACAAGCGTAAGTTCCACGAAAAGCACCACTCACACCGTGGTTACTTCAAGCGTATTGTTCAACGTATTAAGGACTTCCTTCGTAACCTTGGTACC-3'，斜體部分堿基分別為HindⅢ和KpnⅠ酶 切 位 點， 下 劃 線 為6x His-Tag 組 氨 酸 標 簽序列。

2.2 H5LL 的成肽可能性預測結果通過CAMPR4 數據庫的判別分析器（discriminant analyzer， DA） 及 支 持 向 量 機（support vector machine，SVM）2 種算法預測雜合肽的抑菌活性，平均得分越高（最高分為1），預測其成為AMPs可能性越高。由DA 算法可知，H5LL 成為AMPs的DA 值為0.993，SVM 為0.819，平均得分為0.76，其成為AMPs 的可能性較高。

2.3 H5LL 的理化性質預測結果H5LL 由36 個氨基酸組成，相對分子質量為4 625 380，分子式為C210H3285N74O46。疏水性氨基酸9 個，雖然疏水性與AMPs 抑菌活性成正比例，但疏水性氨基酸并不決定整個多肽的疏水性，只能起到一定的參考作用［20］。總電荷數為+10，說明H5LL 為陽離子雜合肽。不穩定指數與肽的穩定性有關，不穩定指數低于40 推斷肽序列穩定，不穩定指數為30.08 證明H5LL 穩定性較好。脂肪指數定義為多肽中脂肪族氨基酸（纈氨酸、丙亮氨酸和異亮氨酸）所占的相對比例，預測多肽熱穩定性，從結果可看出，H5LL 熱穩定性較好。 總平均親水性（total average hydrophilicity ，GRAVY）［21］是計算肽的疏水性/溶解度，取值在-2～2，負值表明為親水性，H5LL 是具有較強親水性的多肽。雜合肽H5LL 序列的氨基酸組成見圖1，理化性質預測部分結果見表3。

圖1 H5LL 的氨基酸組成Fig.1 Amino acid compositions of H5LL

表3 H5LL 理化性質預測結果Tab.3 Prediction results of physical and chemical properties of H5LL

2.4 H5LL 疏水性預測結果ProtScale 在線網站分析結果顯示：H5LL 的最大疏水指數為 4.500，位于第10 位氨基酸，最小疏水指數為-4.500，位于第2 位氨基酸，總體親水性大于疏水性（圖2）。DNAStar 數據庫中的Protean 分析結果顯示：多肽鏈親水性主要集中在N 端。2 種結果預測均顯示雜合肽H5LL為親水性蛋白，與理化性質一致（圖3）。

圖2 ProtScale 預測H5LL 疏水性Fig.2 Hydrophobicity of H5LL predicted by ProtScale

圖3 DNAStar 預測H5LL 疏水性Fig.3 Hydrophobicity of H5LL predicted by DNAStar

2.5 H5LL 酶切位點預測結果PeptideCutter 預測結果顯示：H5LL 中出現較多的剪切位點多集中在肽鏈兩端。H5LL 兩端為親水性，穩定性較弱，所以易被剪切。其中，剪切位點較多的酶主要有胰蛋白酶、蛋白酶K 和低特異性糜蛋白酶。見表4。

表4 H5LL 酶切位點預測結果Tab.4 Predicted results of H5LL digestion sites

2.6 H5LL 磷酸化位點和糖基化位點預測結果

H5LL 存在3 個潛在的磷酸化位點，第7 和21 位為酪氨酸修飾位點，第17 位為絲氨酸位點。不存在糖基化位點。見圖4 和5。

圖4 H5LL 磷酸化位點預測結果Fig.4 Prediction results of phosphation sites of H5LL

圖5 H5LL 糖基化位點預測結果Fig.5 Prediction results of glycosylation sites of H5LL

2.7 H5LL 跨膜區域預測結果TMHMM Server v.2.0 預測結果見圖6，天藍色線表示各氨基酸處于膜內的概率，表明H5LL 不含跨膜區域，屬于膜內蛋白。

圖6 H5LL 跨膜區域預測結果Fig.6 Prediction results of H5LL transmembrane region

2.8 H5LL 信號肽預測結果H5LL 信號肽的Sec/SPI 為0.004 4， 該 雜 合 肽 無 信 肽 存 在。SignalP-5.0 預測H5LL 信號肽結果見圖7。

圖7 SignalP-5.0 預測H5LL 信號肽Fig.7 H5LL signal peptides predicted by SignalP-5.0

2.9 H5LL 亞細胞定位預測結果TargetP-1.1 Server 預測H5LL 亞細胞定位結果顯示：線粒體靶向肽的可能性為0.333，分泌通路信號肽可能性為0.033，其他蛋白的可能性為0.731。

2.10 H5LL 二級結構預測結果在線網站SOPMA 預測H5LL 的二級結構結果顯示：有19 個 氨 基 酸 參 與α-螺旋（藍色） 的形成，占52.78%；8 個氨基酸參與β-轉角（綠色）的形成，占22.22%；6 個氨基酸參與無規卷曲（紫色）的形成，占16.67%；延伸鏈3 個，占8.33%。結果顯示雜合肽H5LL 結構主要以α-螺旋為主，β-轉角次之，可預測其具有較強抑菌活性及穩定性。采用 DNAStar 軟件中的Protean 預測H5LL 二級結構的具體區域見圖8。

圖8 SOPMA 網站(A) 和DNAStar 數據庫(B)預測H5LL二級結構Fig.8 Secondary structure of H5LL predicted by SOPMA Website (A) DNAStar Database(B)

2.11 H5LL 三級結構預測結果H5LL 的三級結構中α-螺旋數量較多，與二級結構預測結果相符。見圖9。

圖9 SWISS-MODEL(A)和Phyre(B)網站預測H5LL 的三級結構Fig.9 Tertiary structure of H5LL predicted by SWISSMODEL(A) and Phyre(B) Websites

2.12 目的片段和表達載體的獲取pUC57-H5LL和pMG36e 質粒在HindⅢ和KpnⅠ酶切位點進行雙酶切，酶切產物電泳結果顯示目的基因小片段和空載質粒片段分別為136 和3 500 bp，條帶大小與理論值相符。回收得到帶有黏性末端的H5LL 目的基因和空載pMG36e DNA 質粒。見圖10。

圖10 pUC57-H5LL 和pMG36e 質粒雙酶切電泳圖Fig.10 Electrophoregram of double digestion of pUC57-H5LL and pMG36e plasmids

2.13 重組質粒pMG36e-H5LL 的驗證結果在138 bp 處有清晰明亮條帶，目的基因與目的條帶大小相符。陽性菌落質粒雙酶切后行電泳，在136 和3 500 bp 處有清晰條帶，因為pMG36e 是低拷貝數質粒，重組質粒濃度低，所以在雙酶切電泳后136 bp 處條帶較淺。證明已經成功構建重組表達載體pMG36e-H5LL。重組質粒的PCR 和酶切電泳結果見圖11 和12。

圖11 重組質粒PCR 電泳圖Fig.11 PCR electrophoregram of recombinant plasmids

圖12 重組質粒酶切電泳圖Fig.12 Digestion electrophoregram of recombinant plasmid

3 討 論

信號肽可將蛋白質引入到細胞中含不同膜結構的亞細胞器中，引導真核和原核生物蛋白質的分泌［18］。AMPs 的 二 級 結 構 一 般 包 含α-螺 旋、延 伸鏈、β-轉角和無規卷曲，是多肽鏈中主鏈原子的局部空間構象。二級結構對AMPs 發揮抑菌作用意義重大，具有兩親性α-螺旋的AMPs 通過靜電吸引與細菌膜結合，疏水端插入到胞膜中，破壞細菌膜結構，進而產生抑制細菌作用［19］。因此，AMPs 結構中α-螺旋的比例與抑菌活性有關。同時β-轉角也影響AMPs 的穩定性。近年來，抗生素廣泛應用于醫療衛生、食品安全和畜牧業等領域［20-22］，但隨著抗生素的過度使用，抗生素耐藥已成為全球公共衛生領域亟待解決問題之一［23］，尋找替代抗生素的新藥已成為治療耐藥菌感染的首要任務。AMPs Hst5 是人類和高級靈長類動物唾液分泌物組成成分 之 一， Hst3 的 水 解 產 物［6］可 中 和 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS），降低齲齒發生率，抑制或殺滅白假絲酵母菌和變異鏈球菌等，是宿主非防御系統的重要組成部分。有研究［24］顯示：患齲齒兒童唾液中Hst5 濃度明顯低于無齲兒童，且Hst5 濃度隨著齲齒嚴重程度增加而逐漸降低。AMPs LL37 普遍存在于人體各組織和細胞中，具有抗菌、抗腫瘤、抗感染和參與免疫調節等多種生物學活性。在抗菌方面，帶正電荷的陽離子AMPs LL37 極易與胞壁帶負電荷的磷壁酸或LPS 的革蘭陽性或革蘭陰性細菌相結合，破壞細菌細胞壁，從而使細胞壁解體、細胞內物質外流，導致細菌死亡。對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等均有較好的抑菌或殺菌效果［25］。為提高Hst5 和LL37 的抗菌活性及穩定性，同時降低細胞毒性，在兩者基礎上對親本肽進行改造，根據乳酸菌密碼子偏愛性，優化設計并合成雜合肽H5LL。

對雜合肽進行生物信息學活性分析結果顯示：CAMP 數據庫預測H5LL 成為AMPs 的概率較高；理化性質和疏水性預測：H5LL 是具有良好穩定性、半衰期較長的陽離子親水性雜合肽；PeptideCutter軟件預測結果顯示：H5LL 被16 種活性物質剪切，胰蛋白酶和蛋白酶K 有較多剪切位點；TMHMM Server v.2.0 預測H5LL 不含跨膜區域，且屬于膜內蛋白；無信號肽；在第7、17 和21 位存在3 個潛在的磷酸化位點，無糖基化位點；二級和三級結構預測結果顯示：α-螺旋均占比最高、β-轉角次之，在一定程度上影響雜合AMPs 活性和穩定性。生物信息學預測分析結果顯示：雜合肽H5LL 有極大的應用潛力和價值。但目前AMPs 獲取主要有天然分離、化學合成和基因工程3 種方式。前2 種獲取方式存在成本高、得率低、工序繁瑣和難以大規模生產的問題。采用基因工程技術，通過工程菌構建表達系統，同時對表達載體或外源基因進行改造或修飾，獲得的AMPs 具有高效率、低成本和大量表達等優點，通過構建重組質粒，表達AMPs 有現實意義。現已有的成熟表達系統主要分為兩大類，一是原核表達系統，如大腸埃希菌，重組AMPs His6-Intein-KR12AGPWR6 經大腸埃希菌異源性表達，與化學法合成的KR12AGPWR6 有相似的抗菌活性，基因工程表達法簡單、價格低，易于擴大商業生產規模［26］；另一類是真核表達系統，如酵母菌、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等，富含半胱氨酸的小型植物AMPs Snakin-1在畢赤酵母中得到高效表達，表達水平為40 mg·L－1［27］，其中最為經濟簡單的方法是原核表達系統［28］。但AMPs 在大腸埃希菌系統中表達時有諸多局限性，如AMPs 對宿主細胞的毒性作用限制其表達，且容易被大腸埃希菌細胞質中的蛋白酶降解，降低其表達量。

原核表達系統中的乳酸菌多數是公認安全食品級微生物，具有改善腸道微生物菌群和腸道功能、降低血清膽固醇、增強機體免疫功能、改善食物代謝及延緩機體衰老等生理功能。作為基因工程菌表達和傳遞外源基因時，具有益生性，同時乳酸菌可以在人或動物胃腸道內定植存活，尤其不刺激機體免疫系統產生抗體，不產生內毒素，表達的外源蛋白無須經過純化和復性等過程，近年來在食品加工及臨床治療等相關途徑受到越來越多的關注。ZENG 等［29］成功實現了AMPs HD-5 在乳酸菌中的表達，小鼠口服重組菌株NZ9000SHD-5 后，腸黏膜損傷緩解，這為潰瘍性結腸炎提供了新的治療手段。

本課題組在合成并預測分析雜合肽H5LL 基礎上，將其與表達質粒pMG36e 構建重組表達載體pMG36e-H5LL，為雜合肽H5LL 在乳酸菌中的表達提供實驗基礎；本研究結果為解決抗生素耐藥性問題和獲取具備臨床應用價值的新型AMPs 提供實驗方向，為AMPs 基因工程規模化生產和安全性使用提供實驗指導。后續仍需進一步對表達雜合肽抑菌活性、穩定性和細胞毒性等進行實驗驗證，為獲得可用于醫療衛生、食品工業及保健業等領域的新型AMPs 的開發提供依據。