Sirt1促進炎癥牙周膜干細胞成骨分化的機制

孔祥偉,尹 偉,王晨辰,張 林,程義成

牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)在牙周組織再生修復中發揮重要作用[1]。然而,炎癥PDLSCs的再生功能受損,給牙周炎患者使用自體PDLSCs治療帶來困難[2-3]。細菌感染和慢性炎癥會導致細胞發生表觀遺傳修飾的改變,從而導致再生能力的下降。去乙酰化酶1(Sirtuin 1,Sirt1)在多細胞有機體中廣泛存在,通過將組蛋白去乙酰化,參與多種生命過程[4]。Sirt1也是骨密度的重要調節因子[5]。但Sirt1對炎癥PDLSCs成骨分化的影響及其機制尚未見相關研究報道。該研究在炎癥PDLSCs成骨誘導過程中使用Sirt1激動劑白蘆藜醇上調細胞中的Sirt1,觀察Sirt1對炎癥PDLSCs成骨分化的影響;同時,檢測叉頭框蛋白O(forkhead box O protein,FoxO)和核內轉錄調節因子κB(nuclear factor-κb,NF-κB)的表達,明確Sirt1調控炎癥PDLSCs的分子機制可以為恢復疾病狀態下干細胞的再生能力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM 培養基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、PBS(美國Gibco公司);I型膠原酶、胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、LPS(美國Sigma公司);白蘆藜醇(美國Selleckchemicals公司);谷氨酰胺、TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司);BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒、RIPA細胞裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司);Sirt1抗體、Runx2抗體(美國Cell Signaling公司);乙酰化NF-κB抗體、乙酰化FoxO1抗體、FoxO1抗體(美國Abcam公司);β-actin抗體(江蘇康為世紀生物技術有限公司);ECL發光試劑盒(美國Pierce公司);7500型快速實時熒光定量PCR儀(德國Applied Biosystems公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);JS-860A自動凝膠成像儀(上海培清科技有限公司)。

1.2 正常與炎癥PDLSCs的分離和培養正常PDLSCs來自于健康個體,年齡20～35(28.00±3.53)歲;炎癥PDLSCs來自于慢性牙周炎患者,年齡31～40(35.00±4.27)歲。兩種組織均來自于因正畸需要而拔除的、無齲壞的前磨牙。用無菌手術刀片刮取牙齒根中1/3的牙周膜組織,接種至6孔板內,每隔3 d更換培養液,直至有細胞從組織塊邊緣爬出。細胞生長達80%匯合時胰酶消化傳代。取第3～5代細胞用于本實驗研究。

1.3 成骨誘導分化取炎癥PDLSCs制備細胞懸液,以2×104/孔的密度接種于6孔板中,在細胞達到70%匯合后,將培養液更換為成骨誘導液(含5%胎牛血清的 DMEM,地塞米松0.1 mol/L,β-甘油磷酸鈉0.01 mol/L,維生素C 5×10-5mol/L),每隔3 d換液。倒置相差顯微鏡下觀察,細胞呈復層生長并出現圓形結節。實驗分為4組,① 對照組:炎癥PDLSCs;② 白蘆藜醇組:炎癥PDLSCs+白蘆藜醇;③ 成骨誘導組:炎癥PDLSCs+成骨誘導;④ 成骨誘導+白蘆藜醇組:炎癥PDLSCs+成骨誘導+白蘆藜醇。

1.4 ALP染色吸棄培養液,PBS洗滌,4%多聚甲醛固定1 h,PBS洗滌后,每孔加入1 ml BCIP/NBT工作液,室溫避光放置30 min,吸棄工作液,PBS洗滌,顯微鏡下拍照。

1.5 實時定量PCR檢測收集培養的炎癥PDLSCs,加入TRIzol Reagent裂解細胞,提取總RNA。反轉錄操作步驟按照反轉錄試劑盒的說明書進行。進行反轉錄反應后,將得到的cDNA模板按照SYBR?Premix Ex TaqTM II(TaKaRa Code:DRR081)操作說明書加入檢測體系,使用ABI 7500實時定量儀進行Real-time PCR反應。檢測ALP、Runx2、OCN和Osx的表達,β-actin為內參。引物序列由上海生物工程公司設計合成,見表1。

表1 引物序列

1.6 Western blot檢測使用RIPA裂解液提取細胞蛋白。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。按照4 ∶1的比例加入5×loading buffer,100 ℃、5 min水煮變性。將蛋白樣本用1×loading buffer調整到同一體積。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳停止后切膠、轉膜。5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h。封一抗,4 ℃過夜。復溫1 h后洗膜液沖洗3次,放入二抗,室溫孵育1 h。ECL發光液A ∶B=1 ∶1混合,注意避光,均勻滴加在膜上,放入JS-860A自動凝膠成像儀曝光。用QuantityOne軟件分析各條帶的灰度值,以β-actin為參照,計算相對灰度值。

2 結果

2.1 Sirt1在正常PDLSCs和炎癥PDLSCs中的表達通過有限稀釋法獲取人正常和炎癥組織來源的PDLSCs,Western blot檢測兩種PDLSCs中去乙酰化酶Sirt1的表達情況。Western blot結果顯示,在正常PDLSCs中Sirt1的蛋白表達水平較高,而在炎癥PDLSCs中Sirt1的表達受到抑制,差異有統計學意義(t=5.237,P<0.01)。見圖1。

圖1 Western blot檢測Sirt1在正常PDLSCs和炎癥PDLSCs中的表達

2.2 白蘆藜醇對炎癥PDLSCs成骨分化的影響在培養的炎癥PDLSCs中加入Sirt1激動劑白蘆藜醇,實時定量PCR和Western blot檢測Sirt1的表達。結果表明,白蘆藜醇可增加炎癥PDLSCs中Sirt1的表達。將炎癥PDLSCs進行成骨誘導,同時使用白蘆藜醇上調炎癥PDLSCs中的Sirt1,誘導3 d后實時定量PCR檢測BSP、Runx2、OCN和Osx mRNA的表達,誘導7 d后進行ALP染色。實時定量PCR結果顯示,與成骨誘導組比較,在成骨誘導時加入白蘆藜醇可增加BSP(t=14.045,P<0.01)、Runx2(t=3.349,P<0.01)、OCN(t=7.218,P<0.01)和Osx (t=4.544,P<0.01)mRNA的表達。ALP染色結果表明,成骨誘導+白蘆藜醇組的ALP染色較成骨誘導組增強(t=11.513,P<0.01),說明白蘆藜醇可增強炎癥PDLSCs的成骨分化。見圖2、表2。

圖2 實時定量PCR和Western blot檢測白蘆藜醇對炎癥PDLSCs中Sirt1表達的影響

表2 實時定量PCR檢測BSP、Runx2、OCN和Osx mRNA相對表達量

2.3 Sirt1對炎癥PDLSCs成骨誘導過程中FoxO1和NF-κB表達的影響將炎癥PDLSCs進行成骨誘導,同時使用白蘆藜醇上調炎癥PDLSCs中的Sirt1,成骨誘導7 d,Western blot檢測Sirt1、乙酰化NF-κB、乙酰化FoxO1、FoxO1和Runx2的表達。結果顯示:與對照組比較,炎癥PDLSCs成骨誘導后FoxO1(t=8.737,P<0.01)和Runx2(t=6.152,P<0.01)的表達增強;在成骨誘導+白蘆藜醇組中,炎癥PDLSCs中Sirt1(F=71.260,P<0.01)的表達較對照組和成骨誘導組上調,同時FoxO1(t=5.912,P<0.01)和Runx2(t=6.277,P<0.01)的表達較成骨誘導組進一步增加,而乙酰化NF-κB(F=184.033,P<0.01)和乙酰化FoxO1(F=301.454,P<0.01)的表達較對照組和成骨誘導組明顯降低。見圖3。

圖3 Western blot檢測炎癥PDLSCs中Sirt1、乙酰化NF-κB、乙酰化FoxO1、FoxO1和Runx2的表達

3 討論

表觀遺傳學是指在基因的核苷酸序列不發生改變的情況下,由于體內、外環境因素的影響,基因表達了可遺傳的變化[6]。近年來研究發現,人體多種疾病的發生、發展都與表觀遺傳密切相關。類風濕關節炎患者的間充質干細胞表現出較低的增殖能力,并且數量會隨著年齡的增加而減少[7]。系統性紅斑狼瘡患者的骨髓間充質干細胞則表現出成骨能力的下降[8]。課題組在前期的實驗中[9]觀察到炎癥PDLSCs在脫離炎癥環境后,經過長期的體外培養和傳代,仍然存在成骨功能的缺陷,這可能是由于在長期的慢性炎癥微環境中PDLSCs發生了表觀遺傳的改變。

表觀遺傳現象包括 DNA甲基化,組蛋白甲基化、乙酰化和泛素化等。其中,組蛋白乙酰化作用主要由兩種功能相反的酶——組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)來完成。HATs通過對組蛋白產生乙酰化作用,導致特定位點的染色質解螺旋,從而起到轉錄活化的作用;而HDACs可將組蛋白尾部的乙酰基去除,起轉錄抑制的作用[10]。Sirt1是一種在細胞中廣泛存在的去乙酰化酶,可通過去乙酰化作用,維持細胞內環境的穩態,調控基因的表達,參與細胞的增殖、分化、衰老、凋亡和炎癥等生命活動過程[11]。Sirt1通過對多種轉錄后調節因子的去乙酰化,如p53、FOXO、NF-κB以及過氧化物酶體增殖體激活受體γ等,調控細胞周期,參與DNA雙鏈修復以及基因沉默等過程,與眾多疾病相關[11]。本研究比較了正常及炎癥組織來源的PDLSCs中Sirt1的表達,發現在正常PDLSCs中Sirt1的蛋白表達水平較高,而在炎癥PDLSCs中Sirt1的表達受到抑制。有研究[12]報道,在動脈粥樣硬化小鼠主動脈中Sirt1的表達受到抑制,與miR-29c的表達上調有關。同樣,LPS誘導的外周血單核細胞中Sirt1的表達下調,可能與miR-217的高表達有關[13]。由此推測,炎癥PDLSCs中Sirt1的表達下調可能與干細胞微環境的改變有關。本研究使用Sirt1激動劑白蘆藜醇上調炎癥PDLSCs中的Sirt1,結果發現白蘆藜醇可以有效促進炎癥PDLSCs的成骨分化,說明Sirt1在炎癥PDLSCs成骨分化的過程中起到了積極的作用。

目前已知受到Sirt1調控的分子包括NF-κB、FoxO1等轉錄因子。NF-κB的乙酰化是其發揮轉錄活性、激活炎癥反應的必要條件。Chen et al[14]研究表明,TNF-α激活NF-κB后,PDLSCs成骨分化受到抑制。本研究發現,在炎癥PDLSCs中Sirt1的表達較低而乙酰化NF-κB的表達較高;在加入白蘆藜醇上調Sirt1后,乙酰化NF-κB的表達下降,成骨相關蛋白Runx2的表達增多,說明乙酰化NF-κB在炎癥PDLSCs的成骨分化中起負向調控作用。FoxO1是調控成骨的重要因子。在成骨細胞中FoxO1可對抗骨骼內的氧化應激反應,維持成骨細胞的正常增殖;在破骨細胞中FoxO1可促進成骨細胞前體向成骨細胞分化,對破骨細胞有抑制作用[15]。FoxO1的乙酰化能夠促進其磷酸化,從而進一步發生泛素化降解。本研究發現,炎癥PDLSCs成骨誘導后FoxO1的表達較對照組增強,在加入白蘆藜醇上調Sirt1后FoxO1的表達進一步增強,與成骨相關蛋白Runx2的表達趨勢一致,而乙酰化FoxO1的表達與FoxO1相反。以上結果表明,Sirt1可以上調炎癥PDLSCs中FoxO1的表達,同時下調乙酰乙酰化FoxO1的表達,促進炎癥PDLSCs的成骨分化。

綜上所述,去乙酰化酶Sirt1可能通過去乙酰化NF-κB和FoxO1,從而促進炎癥PDLSCs的成骨分化,明確Sirt1調控炎癥PDLSCs成骨分化的分子機制可以為恢復干細胞的再生能力提供理論依據,為恢復牙周炎中牙周膜干細胞的再生能力提供新的靶點。