膠質母細胞瘤銅死亡相關lncRNA預后模型的構建

鄧云良

膠質母細胞瘤是最常見的顱內原發性惡性腫瘤，預后極差[1，2]。探討膠質母細胞瘤的發病機制，對提高膠質母細胞瘤的診治水平具有重要意義。2022年，Tsvetkov 等[3]發現一種新的細胞死亡方式，其稱之為cuproptosis，中文譯名為銅死亡，這是不同于細胞凋亡、壞死性凋亡、焦亡和鐵死亡的新型細胞死亡方式[4，5]。本文采用生物信息學方法分析膠質母細胞瘤差異表達的銅死亡相關長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）并構建預后模型。

1 資料和方法

1.1 數據的下載計算機檢索TCGA 數據庫（https://portal.gdc.cancer.gov/），下載膠質母細胞瘤的RNAseq數據及其臨床信息。

1.2 銅死亡基因相關lncRNA的篩選查閱文獻發現17 個銅死亡基因參與銅死亡過程[3，5]；然后，進行銅死亡基因和lncRNA的共表達分析，篩選標準為相關系數≥|±0.4|，P≤0.001。

1.3 預后模型的構建和驗證應用單因素Cox分析和LASSO 回歸篩選預后預測模型的銅死亡相關ln?cRNA，并計算風險評分=基因系數×基因表達量，以風險評分中位數分為低風險組和高風險組。將膠質母細胞瘤樣本隨機分為測試組和訓練組，再進行整合生物信息學分析。

1.4 差異表達lncRNA的GO 和KEGG 富集分析 通過對所有樣本的高、低風險組進行差異表達分析，得到差異表達基因（篩選標準為LogFC≥|±0.585|，FDR<0.05），然后進行GO和KEGG富集分析。

2 結果

2.1 膠質母細胞瘤銅死亡相關lncRNA 的篩選共下載膠質母細胞瘤樣本169 例，對照樣本5 例，共表達分析發現791個銅死亡相關lncRNA，其中正相關ln?cRNA有753個，負相關lncRNA有38個。

2.2 膠質母細胞瘤預后預測模型的構建單因素Cox分析發現22 個顯著差異表達的lncRNA（P<0.05；表1），LASSO回歸分析篩選9個差異表達的lncRNA，根據基因系數計算風險評分=（0.537×AC025171.1基因表達量）+（0.890×LINC02449基因表達量）+（-0.469×SOX21-AS1 基因表達量）+（-0.503×AL136366.1 基因表達量）+（0.861×AL117332.1 基因表達量）+（-0.485×AL133523.1 基因表達量）+（0.652×GS1-124K5.4 基因表達量）+（0.819×LINC02328 基因表達量）+（3.00×AC010641.2基因表達量），根據風險評分中位數分為高分險組、低分險組。

表1 單因素Cox 分析發現22 個顯著差異表達的膠質母細胞瘤銅死亡相關lncRNA

將169 例TCGA 膠質母細胞瘤樣本隨機分為測試組和訓練組，兩組臨床特征無統計學差異（P>0.05；表2）。

表2 TCGA數據庫樣本測試組與訓練組臨床特征比較無統計學差異

多因素Cox 回歸分析顯示風險評分增高是膠質母細胞瘤預后不良的獨立危險因素（P<0.05，表3）。生存曲線分析顯示，無論是訓練組，還是測試組，高風險組總體生存期和無進展生存期顯著縮短（圖1；P<0.05）。ROC 曲線分析顯示模型對1、2、3 年生存期具有良好的預測價值（圖2A），而且風險評分預測效能顯著優于其他臨床信息（圖2B）。

圖1 生存曲線分析銅死亡相關lncRNA的風險評分與膠質母細胞瘤病人生存預后的關系

圖2 ROC曲線分析模型預測膠質母細胞瘤病人1、2、3年生存率的效能

表3 膠質母細胞瘤預后不良風險因素的Cox比例回歸風險模型分析

2.3 差異表達基因的富集分析所有樣本進行差異分析發現上調差異基因247 個，下調差異基因74個。GO 分析顯示生物過程主要富集于趨化因子和細胞因子的激活、細胞成分主要富集于細胞質、分子功能主要富集于結合活性；KEGG 富集分析主要富集在NF-κB 信號通路、TNF 信號通路和癌癥中的轉錄錯調中。這表明銅死亡相關lncRNA 可能通過相關腫瘤通路促進腫瘤的發生和進展。

3 討論

銅死亡是由銅觸發的，銅可以刺激受調節的相關依賴細胞增殖，并且參與線粒體呼吸、抗氧化、自噬、激酶傳遞等一系列細胞過程[6]。銅是人體的基本營養素，其富含在種子、堅果等食物中，成人推薦攝入量約為0.9 mg，銅吸收主要依賴于銅轉運蛋白1（copper transporter 1，CTR1），排出主要依賴銅轉運ATP 酶α多肽[6～9]。銅代謝異常可能與癌癥具有相關性。研究發現惡性神經膠質瘤銅濃度顯著增高，而銅是一種重要的血管生成因子，并在惡性膠質瘤中蓄積[10]。Tsvetkov等[3]發現銅在線粒體的累積可導致銅驅動三羧酸循環中的脂酰化過程，最終引起銅死亡。另外，Brem 等[11]在膠質母細胞瘤中的一項2 期藥物試驗中發現低血清銅水平可以抑制腫瘤生長和腫瘤血管生成，但使用青霉胺治療或降低血銅水平，膠質母細胞瘤病人的生存率并沒有明顯改善。這表明銅參與腫瘤的發生和發展。

研究發現，SOX21-AS1 基因在膠質瘤中可海綿化miR-144-3P，上調PAK7表達，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[12]。Wang 等[13]通過SOX21-AS1、HOTAIR、STEAP3-AS1 等lncRNA 構建膠質母細胞瘤外泌體的預后預測模型。本文通過Cox分析和LASSO回歸分析篩選出9 個銅死亡相關lncRNA，通過整合生物信息學分析，構建預后預測模型，發現預測模型能有效預測膠質母細胞瘤病人的預后。此外，預后模型差異基因的GO分析顯示其主要富集在趨化因子，這可能是由于腫瘤衍生趨化產生[14]。另外，KEGG通路分析顯示差異基因富集在多條腫瘤相關通路，如NF-κB 信號通路，該通路與膠質母細胞瘤放療不敏感、侵襲和轉移有關[15，16]。