LC/MS/MS法同時測定八寶驚風散中5種成分的含量

張艷萍,張 敏,周宗洲,黃婉鋒, 何作民

(1.廣東省佛山市食品藥品檢驗檢測中心,廣東 佛山 528051; 2.廣東省佛山市疾病預防控制中心,廣東 佛山 528051)

八寶驚風散為兒科經典用藥,由鉤藤、防風、黃芩、沉香等19味中藥粉碎成細粉,過篩,混勻而成,具有退熱鎮驚、祛風化痰等功效[1-2],由于效果明顯,深受兒童消費者的青睞。八寶驚風散現行藥品執行標準為衛生部頒藥品標準(中藥成方制劑第20冊)WS3-B-3742-98,標準較簡單,只包括性狀項、茯苓、川貝母、黃芩、珍珠顯微鑒別、2項理化鑒別、丁香的薄層鑒別和檢查項,目前尚未有定量指標,這對其產品研究和臨床應用具有阻礙作用。由于處方成分復雜,八寶驚風散的質量控制手段有薄層鑒別、單組分氣相色譜法或液相色譜法[3-10]。經文獻查閱,關于采用液質聯用法對八寶驚風散中單一或多種組分的含量檢測研究尚未報道。本實驗采用正離子掃描,多反應監測模式,建立同時測定八寶驚風散中鉤藤活性成分異鉤藤堿、防風活性成分升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷,黃芩活性成分黃芩苷、沉香活性成分沉香四醇的LC-MS/MS檢測方法。以期為該中成藥的質量控制提供更全面、高效、可靠的分析方法,為其質量標準提高提供技術支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Xevo-TQ 三重四級桿液質聯用儀(美國Waters);ELGA Q7純水超純水機(法國威立雅);XPR10微量天平(梅特勒-托利多);BS224S電子天平(德國Sartorius);S180/H超聲波清洗器(Elma);MS2迷你渦旋振蕩器(德國IKA);CT14RD 臺式高速冷凍離心機(上海天美)。

1.2 試劑

對照品升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號 111523-200405,含量100%)、黃芩苷、異鉤藤堿全部購自中國食品藥品檢定研究院。色譜純試劑:乙腈、甲醇、甲酸,水為實驗用超純水。藥品八寶驚風散(4家生產企業共10批次)均來源于市售。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液的制備

精密稱取異鉤藤堿約4mg、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷約10mg、沉香四醇、黃芩苷約20mg置于10mL量瓶中,加甲醇溶解并定容,配制含量范圍為0.40～2.0mg/mL的對照品單標儲備液。

2.1.2 混合對照品中間液的制備

準確移取上述對照品儲備溶液適量置同一量瓶(20 mL),用甲醇稀釋定容, 配制成含量范圍為2.0～10.0μg/mL的混合對照品中間液。

2.1.3 混合標準使用液的制備

精密移取混合對照品中間液適量,配制異鉤藤堿含量范圍約為0.01～0.20μg/mL,升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量范圍約為0.025～0.50μg/mL,沉香四醇、黃芩苷含量范圍約為0.05～1.0μg/mL的混合標準使用液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取八寶驚風散細粉約0.5g置于20mL量瓶中,加入適量甲醇,渦旋30s,放置超聲清洗器提取20min,放冷,甲醇定容,搖勻后轉移至10mL的離心管中,以12000 r/min離心 5 min,取適量上清液過0.22μm濾膜獲得供試品溶液,如樣品中部分成分濃度超出曲線線性范圍,可采用10%乙腈溶液稀釋,再進樣分析。

2.3 色譜與質譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱 ACQUITY UPLC C18 柱(1.7μm,2.1mm×100 mm),流動相為0.1%甲酸溶液(A)-甲醇溶液(B),流速:0.30mL/min,柱溫:30℃, 進樣量:1μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 質譜條件

電噴霧離子源,離子源:150℃,正離子監測,毛細管電壓3.6KV,多反應監測,氬氣為碰撞氣,各成分質譜檢測參數見表2,標準圖譜見圖1。

圖1 標準TIC圖譜

表2 各成分質譜檢測參數

3 結果

3.1 標準曲線與線性試驗

取混合標準使用溶液各1μL,按“2.3” 項條件進行分析,以對照品峰面積Y對其濃度X進行回歸,結果見表3,結果表明各成分在各自質量濃度范圍內線性關系良好。按照樣品稱樣量0.20g,定容20mL,以3∶1信噪比為檢出限,以10∶1為定量限信噪比,計算各成分檢出限、定量限,結果見表3。

表3 各成分的線性回歸方程、相關系數等

3.2 精密度試驗

對某一混合標準使用溶液連續進樣 6次,測得升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿峰面積的RSD分別為3.0%、4.2%、3.0%、4.8%、2.0%,結果表明,儀器具有良好的精密度。

3.3 重復性試驗

稱取八寶驚風散(批號170302)適量共6份,按“2.2”項制備6份供試品溶液;按“2.3”項進樣測定,計算升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的含量平均值分別為106.3mg/kg、640.2mg/kg、58.9mg/kg、2401.7mg/kg、2.15 mg/kg,RSD分別為4.2%、2.9%、3.7%、2.0%、4.8%,表明該法重復性較好。

3.4 穩定性試驗

取“2.2”項供試品溶液(批號170302),分別于0h、1.0h、2.0h、4.0h、8.0h、12.0h、24.0h進行測定,結果升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿峰面積的RSD依次為4.1%、3.8%、3.2%、4.3%、3.5%,表明樣品溶液在24h內呈現良好穩定性。

3.5 回收率實驗

精密稱取已知含量的八寶驚風散(170302)6份,每份稱量約0.5g,置于20mL量瓶中,加入各對照品儲備溶液,按“2.2”項制備待測液,進樣分析,計算回收率,結果見表4。

表4 各成分回收率和RSD(n=6)

3.6 方法應用

在本實驗條件下,按照“2.2”項對10批八寶驚風散藥品制備供試品溶液,按“2.3”項下色譜與質譜條件進行測定,外標法計算各成分的含量,其代表性圖譜見圖2,結果見表5。

圖2 樣品總離子流圖 批號170302

表5 八寶驚風散中各成分的含量測定結果(mg/kg)

4 討論

4.1 提取方法優化

為確保八寶驚風散中各成分的有效提取與準確定量,本文考察了多種提取溶劑(50%甲醇溶液、甲醇、50%乙腈溶液、乙腈)對提取效率的影響,結果表明,采用純甲醇提取可獲得滿意結果。同時考察了不同的超聲提取時間(10 min、20 min、30 min)對提取效率的影響,發現超聲提取20 min能滿足檢測方法要求。

4.2 色譜條件的優化

目前對于八寶驚風散的質量控制的研究主要為HPLC、UPLC等分析方法,各成分如需完全分離,洗脫時間較長,本研究運用特異性高的UPLC-MS/MS法,能顯著縮短樣品分析時間,試驗分別考察了甲醇和乙腈與揮發性緩沖液(0.1%甲酸水溶液、10 mmol乙酸銨溶液)組成的流動相體系對八寶驚風散中5種成分的離子化程度的影響。結果表明,當流動相體系為甲醇-0.1%甲酸時,各組分響應最高,峰型最優。同時通過優化此流動相體系的梯度洗脫程序,使5種成分在5min內獲得最佳分離。采用亞二微米小顆粒填料色譜柱能獲得較高靈敏度和分離度,本文分別對 BEH C8、C18色譜柱進行了考察,結果發現,C18柱無論在峰型方面還是分離度方面,均優于C8柱,因此,本實驗選擇C18色譜柱。

4.3 不同生產廠家樣品中5種成分的含量分析

從表5可知,該研究中5種組分在四家藥品生產企業均有檢出,但由于各企業藥材原料的生產產地和來源的差異,升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的含量存在不同程度的差異。黃芩苷含量最高,含量范圍為1860.7～3740.2mg/kg,異構藤堿含量最低,含量范圍為0.82～7.89mg/kg,同時,5種成分在不同廠家,不同批號其其含量相差也較大。不同批號中異鉤藤堿的含量差異高達10倍,八寶驚風散處方中主藥包括鉤藤、防風。因此,八寶驚風散中異構藤堿、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量的差異將有效體現改藥品的質量。

建立同時測定八寶驚風散中升麻素苷、沉香四醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、異鉤藤堿的液質檢測方法,該法靈敏度高,分析速度快,回收率好。LC/MS/MS法能有效排除樣品基質干擾,結果準確、可靠,可為八寶驚風散質量標準提高、藥效物質深入研究等提供技術參保障用藥安全。