三種色胺類物質誘導的小鼠條件性位置偏愛研究

李楠，李鋒，魏佳韻，喬艷玲,3，李香豫，王優美,3，徐鵬,3*，狄斌*

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學禁毒關鍵技術聯合實驗室，北京100193；3.毒品監測管控與禁毒關鍵技術公安部重點實驗室，公安部禁毒情報技術中心，北京100193）

色胺類物質是一類以色胺為母核的化學物質，具有與神經遞質5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）相似的化學結構和藥理作用，通過與5-HT 受體結合產生致幻效應，其致幻效應強烈，作用時間長，嚴重威脅吸食者健康和公共安全[1]。α-甲色胺（alpha-methyltryptamine，AMT）、5-甲氧-α-甲色胺（5-methoxy-alpha-methyltryptamine，5-MeO-AMT）和5-甲氧-N，N-二異丙色胺（5-methoxy-N，N-diisopropyl tryptamine，5-MeO-DiPT）是三種合成色胺類物質，在國內均被列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品》，受到了嚴格管控，但在國際上，盡管AMT 已受到聯合國1971 年《精神藥物公約》的管控，但5-MeOAMT 與5-MeO-DiPT 只在部分國家受到了管控，且近幾年仍有較多濫用現象[1-3]。有研究認為色胺類物質精神依賴性較低，但相關研究較為匱乏[4]。3，4-亞甲基二氧甲基苯丙胺（MDMA）是常見毒品搖頭丸的主要活性成分，具有較強的精神依賴性和致幻作用。MDMA 與5-HT 受體也具有一定親和力，而且MDMA 引起實驗動物的“搖頭”現象與色胺類物質引起實驗動物的“甩頭”現象類似[5]。本研究通過條件性位置偏愛（Conditioned Place Preference，CPP）實驗，以MDMA 為陽性對照，對三種色胺類物質AMT、5-MeO-AMT 和5-MeO-DiPT 的獎賞效應進行評估，并對其精神依賴性大小進行比較，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級ICR 雄性小鼠，體重18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010。動物房溫度控制在20～25℃，相對濕度控制在50%～65%，12 h 明暗循環照明。實驗開始前，動物在動物房至少適應環境1～2 d，飼料與清潔水可自由攝取。對實驗動物進行的操作均符合實驗動物倫理學，遵循國家動物使用和保護委員會頒布的相關條例。

1.2 實驗藥品與試劑

AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-AMT、5-MeO-DiPT、MDMA 由公安部禁毒情報技術中心提供，純度均≥98%。0.9%氯化鈉注射液（生理鹽水），購自山東齊都藥業有限公司。四種化合物均采用0.9%氯化鈉注射液溶解，實驗前新鮮配制。陰性對照組給予0.9%氯化鈉注射液。

1.3 實驗設備

條件性位置偏愛箱（以下簡稱CPP 箱）及CPP 視頻分析系統（北京眾實迪創科技發展有限責任公司）。CPP 箱采用三室式CPP 箱（400 mm×150 mm×350 mm），箱體的材料為醫用PVC，并由兩塊活動隔板分成左、中、右三室。左右室（170 mm×150 mm×350 mm）大小相等。左室內壁黑色，底部為圓點狀鏤空底板，右室內壁為黑白相間的條紋，底部為圓點與條狀相間鏤空底板。高清攝像頭安裝于CPP 箱正上方以記錄小鼠的活動情況，使用Tracking Master V3.63計算機軟件記錄每個小鼠在每個隔間停留的時間。

1.4 動物分組及給藥

將前篩合格的實驗小鼠按體重隨機分為5 大組：陰性對照組（生理鹽水）、MDMA 不同劑量組（分別為1 mg/kg，3 mg/kg，10 mg/kg）、AMT 不同劑量組（分別為3 mg/kg，10 mg/kg，30 mg/kg）、5-MeOAMT 不同劑量組（分別為3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg）和5-MeO-DiPT 不同劑量組（分別為3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg）。各劑量組小鼠8～12 只，腹腔注射，固定體積給藥。

1.5 實驗方法

實驗前一天，將小鼠放入CPP 箱中以適應環境。正式實驗包括3個階段：前篩、給藥訓練和表達測試[6]。第1 天進行前篩：將小鼠從中間室放入CPP 箱內，使其在箱內自由活動15 min，測定小鼠的天然偏愛傾向。將小鼠天然非偏愛側（右室）作為伴藥箱，另一側（左室）作為非伴藥箱，剔除在左右兩室中天然偏愛差異較大的小鼠（剔除標準：小鼠在左右兩室停留時間差值＞120s）。將前篩合格的小鼠進行分組。第2～6 天進行給藥訓練：放入活動隔板以阻斷CPP 箱內通道，各組小鼠每天上午腹腔給藥，立即放入伴藥箱停留45 min，下午給予生理鹽水，立即放入非伴藥箱停留45 min，陰性對照組小鼠每天上下午都給予生理鹽水，上下午給藥的時間間隔≥6 h。第7 天進行表達測試：在給藥訓練的最后一次給藥的24 h 后進行測試。表達測試當天不給藥。將活動隔板取出，將小鼠從中間室放入CPP 箱內，使其在箱內自由活動15 min。分別記錄小鼠在伴藥箱和非伴藥箱內停留的時間。計算CPP 分數，計算公式為：CPP 分數=伴藥箱停留時間-非伴藥箱停留時間。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 8 軟件進行實驗數據處理，計量資料以（±SEM）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和Bonferroni post hoc檢驗，以P＜0.05 被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDMA 的CPP 實驗結果

單因素方差分析顯示，不同劑量的MDMA[F（3，29）=18.36，P＜0.0001]對CPP 分數有顯著性影響，CPP 分數與給藥劑量在實驗劑量范圍內呈正相關；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，MDMA 在劑量為3mg/kg 和10mg/kg 時能顯著影響CPP 分數的表達，即能使小鼠對伴藥箱產生顯著的位置偏愛。在一定范圍內，隨著給藥劑量的增加，MDMA 誘導的小鼠CPP 分數表達逐漸增強，見圖1。

圖1 不同劑量的MDMA 腹腔給藥訓練后測得的CPP 分數

2.2 三種色胺類物質的CPP 實驗結果

單因素方差分析顯示，不同劑量的AMT[F（3，30）=3.877，P=0.0187]對CPP 分數有顯著性影響；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，AMT 在劑量為30mg/kg 時能誘導小鼠對伴藥箱產生顯著的位置偏愛（圖2A）。不同劑量的5-MeO-AMT[F（3，35）=4.763，P=0.0069]對CPP 分數有顯著性影響；Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，5-MeO-AMT 在劑量為30mg/kg 時能誘導小鼠對伴藥箱產生顯著的位置偏愛（圖2B）。與陰性對照組相比，不同劑量的5-MeO-DiPT 對CPP 分數的表達均無顯著性差異（圖2C）。

圖2 不同劑量的AMT（A）、5-MeO-AMT（B）、5-MeO-DiPT（C）腹腔給藥訓練后測得的CPP 分數

3 討論

3.1 給藥劑量對CPP 分數的影響

本研究結果顯示，MDMA 引起小鼠產生CPP 行為的最小有效劑量為3 mg/kg，而AMT 和5-MeOAMT 的劑量則需要達到30 mg/kg 時才能引起小鼠產生顯著的CPP 行為，在本研究劑量范圍內，5-MeODiPT 不能誘導小鼠產生CPP 行為。分析認為，CPP實驗是評價藥物獎賞效應的經典動物實驗模型，廣泛應用于藥物精神依賴性初步評價。該模型建立的理論依據是巴普洛夫經典條件反射，首先通過反復訓練使動物在環境刺激與藥物作用之間建立聯系，然后通過測試動物對該環境的偏愛程度來測定該藥物的獎賞作用強度[7]。因此，CPP 實驗可評估藥物的獎賞效應和藥物濫用潛在威脅，常用于初步篩查某種藥物是否具有成癮性。MDMA 是常見毒品“搖頭丸”的主要活性成分，能產生致幻作用，對其精神依賴性的研究較多，相關研究顯示[8]，MDMA 腹腔給藥劑量為5 mg/kg 時能誘導小鼠產生顯著的CPP行為，而本研究中MDMA 引起小鼠產生CPP 行為的最小有效劑量（3 mg/kg）與之接近。另有研究[9，10]采用CPP 實驗和自身給藥實驗評估了5-MeO-AMT、吡咯烷基色胺、哌啶基色胺、N，N-二丁基色胺和2-甲基色胺的精神依賴性，結果表明這五種色胺類物質均不能誘導實驗動物的CPP 行為和自身給藥行為，其中5-MeO-AMT 的CPP 實驗只研究了0.3mg/kg、1mg/kg 和3mg/kg 這三個較低的劑量，且均不能誘導小鼠產生顯著的CPP 行為。而本研究結果顯示，盡管5-MeO-AMT 在劑量為3mg/kg 和10mg/kg 時也不能誘導小鼠產生顯著的CPP 行為，但5-MeO-AMT在劑量為30mg/kg 時能夠誘導實驗動物的顯著CPP行為，提示色胺類物質在大劑量長期使用的情況下可能會產生明顯的精神依賴性。

通常情況下，在相同條件下誘導實驗動物開始形成CPP 的劑量越小，說明該物質引起獎賞效應的能力越強。AMT 和5-MeO-AMT 形成CPP 的劑量是MDMA 的10 倍，一定程度上可反映AMT 和5-MeOAMT 的獎賞效應較弱，5-MeO-DiPT 幾乎不具有獎賞效應。以上結果說明了在這幾種物質中，MDMA的獎賞效應最強，與MDMA 相比，三種色胺類物質的獎賞效應較低，其精神依賴性大小相對效力如下：MDMA＞AMT ≈5-MeO-AMT＞5-MeO-DiPT。此 外，盡管5-MeO-DiPT 在本研究的劑量范圍內均不能引起小鼠的CPP 行為，但在實驗過程中觀察到，5-MeODiPT 劑量增加到60 mg/kg 時出現了個別小鼠死亡的現象，提示該劑量可能接近其半數致死劑量，但該劑量下仍不能誘導小鼠產生CPP行為，表明5-MeO-DiPT毒性較強但精神依賴性可能較低。

3.2 影響CPP 結果的可能神經生物學機制分析

MDMA 和三種色胺類物質在獎賞效應上的差異可能與該物質對不同腦區單胺類神經遞質的不同作用有關。目前普遍認為，腦內獎賞效應可能是產生精神依賴性和強迫性覓藥行為的主要原因，中腦邊緣多巴胺（DA）通路是藥物獎賞效應形成的重要神經生物學基礎，5-羥色胺（5-HT）主要對DA起負性調節的作用，因此在藥物的精神依賴性研究中，DA 和5-HT 是研究較多的兩種單胺類神經遞質。MDMA 能激活5-HT 受體和DA 受體，從而產生各種生物學效應。相關研究表明[11]，D1 受體和D2 受體拮抗劑能使MDMA 大鼠自身給藥模型中的劑量-效應曲線右移，證明MDMA 獎賞效應的產生與DA受體的功能改變相關。

而色胺類物質主要通過激活5-HT 受體產生藥理作用，對DA 受體的作用則相對較弱。Nagai F等[12]研 究 表 明，AMT、5-MeO-AMT 和5-MeODiPT 對5-HT 在大鼠腦中的再攝取均有抑制作用，其中AMT（IC50=3.8±0.74×10-7M）的效力與MDMA（IC50=7.2±1.9×10-7M）相當。放射性受體配體結合研究顯示[13]，在色胺類物質中，5-MeO-AMT 與5-HT2A受體的親和力最強（Ki±SD=0.034±0.01 μM），而對DA 受體的親和力較弱。此外，5-MeO-DiPT 對不同腦區內DA 和5-HT 的作用強度可能不同，DA 和5-HT兩種神經遞質的釋放也可能相互影響其具體的機制，需要進一步研究[14]。

CPP 實驗只是判斷藥物是否具有精神依賴性的初步實驗，很多自然性獎賞物質如甜食等也可形成CPP，實驗數據也可能存在較高的假陽性率[15]。此外，色胺類物質普遍具有強烈的致幻效應，致幻效應是一種視覺、聽覺和觸覺等感覺上的主觀效應，實驗動物在給予致幻劑類物質后可能會喪失對外部環境的判斷能力，產生錯誤的主觀感覺，因此僅通過CPP 實驗評估色胺類物質的獎賞效應并不準確。要想得到確定的結果還需要進一步評估，如結合可信度更高、在藥物成癮研究中更為經典的自身給藥實驗和藥物辨別實驗等對色胺類物質進行進一步研究。

3.3 總結與不足

本研究通過CPP 實驗評估了AMT、5-MeO-AMT和5-MeO-DiPT 三種色胺類物質的獎賞效應，并與較為常見的毒品MDMA 進行了比較，結果揭示了盡管色胺類物質的獎賞效應較弱，但該類物質在大劑量長期使用的情況下仍然可以產生明顯精神依賴性，該現象應當引起高度重視。