HMGB1與HMBOX1的高表達在結直腸癌患者預后評估中的作用

王寶良,陳鐵良,吳家劍,董智剛,楊立群

(唐山市協和醫院,1.病理科;2.普通外科;3.麻醉科;4.華北理工大學附屬醫院普通外科;5.唐山市豐南區醫院普通外科,河北 唐山 063000)

結直腸癌是源于大腸腺上皮的惡性腫瘤,可發生在各段大腸,是常見的惡性腫瘤之一。相關數據顯示,中國的結直腸癌發病率處于較高水平,在所有的癌癥中發病率位居第五[1]。目前對于結直腸癌,手術切除病灶并以放療、化療作為輔助治療是最主要的治療方式。結直腸癌的發生主要是由于物理、化學、病毒等因素導致的致癌、致畸變,在該過程中同時涉及原癌基因的激活及抑癌基因的失活[2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是比較有代表性的腫瘤相關基因,與細胞增生、分化、遷移有關[3]。相關研究[4]表明,結直腸癌患者癌組織中HMGB1的高表達可使患者病灶內免疫淋巴細胞浸潤更為明顯,且患者的生存時間相對縮短。核轉錄因子1(homeobox-containing 1,HMBOX1)是一種新型轉錄抑制因子,可參與DNA損傷修復,在機體多種正常組織中均有表達,可控制細胞的增殖、凋亡、轉移及自我更新[5]。本研究欲采用免疫組化方法檢測結直腸癌患者癌組織及遠端結直腸組織HMGB1與HMBOX1的表達情況,探討HMGB1與HMBOX1的高表達在結直腸癌患者預后評估中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2016年11月唐山市協和醫院收治的96例結直腸癌切除術患者作為研究對象。其中男性49例,女性47例;年齡(71.50±3.67)歲;原發位置為右半結腸者25例,左半結腸者32例,直腸39例;TNM分期I～II期60例,III～IV期36例;T1～T2者52例,T3～T4者44例;N0～N1者80例,N2者16例;高分化和中分化59例,低分化37例。納入標準:(1)患者組織病理活檢確診為結直腸癌;所有病理切片均由本院兩名病理醫師復核證實;(2)臨床治療遵守NCCN指南原則[6];(3)患者腫瘤均無遠處轉移;(4)患者臨床及隨訪資料完整。排除標準:(1)患者術前接受放療或化療;(2)由于除腫瘤復發或轉移以外的原因死亡。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 免疫組化

1.2.1 檢測儀器及試劑 脫水機(賽默飛)、包埋機(徠卡)、手動輪轉式石蠟切片機(徠卡)、展片機(愛華)、烤片機(愛華)、生物顯微鏡(奧林巴斯)。HMGB1兔多克隆抗體(上海碧云天),HMBOX1兔多克隆抗體(上海酶聯),辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgG(H+L)(上海碧云天)。

1.2.2 檢測方法 采集患者適量正常結直腸組織與結直腸癌組織,經固定、洗滌、脫水、包埋后制作石蠟切片,切片厚度為4 μm。然后行免疫組織化學染色:將石蠟切片依次經二甲苯與梯度酒精中脫蠟至水,蒸餾水沖洗后,加入3% H2O2浸泡10 min,除去內源性的過氧化氫酶;棄H2O2后使用蒸餾水中洗兩次,再加入14%檸檬酸緩沖液,加熱暴露抗原位點;冷卻至室溫,蒸餾水洗,PBS浸泡5 min×2次;加入5%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉,室溫孵育 10 min;滴加一抗(HMGB1:1∶200;HMBOX1∶1∶200),4 ℃冰箱中保存過夜;PBS沖洗5 min×3次,擦干組織周圍的PBS后滴加二抗,然后置于37 ℃溫箱中30 min;滴加辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgG(H+L)(1∶1 000)37 ℃ 孵育 30 min;PBS沖洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加DAB顯色劑顯色15 min;將顯色后的片子用清水沖洗并浸泡于蘇木精中10 min,復染后脫水、透明、中性樹脂封片,每張切片選取10個200×鏡下視野,由我院兩名專業的病理醫師鏡檢判斷HMGB1與HMBOX1表達狀況。

1.2.3 結果評分及分組 (1)評估 HMGB1染色:陽性細胞數占細胞總數的百分比評分:0%～5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分;染色強度評分:細胞無著色=0分,呈淡黃色=1分,呈黃色=2分,呈棕黃色=3分。最終免疫評分=平均陽性細胞率+細胞著色強弱得分,0～4分納入HMGB1 低表達組,5～7分納入HMGB1 高表達組[7]。(2)評估 HMBOX1染色:陽性細胞數占細胞總數的百分比評分:0%為0分,1%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～100%為3分。染色強度評分:細胞無著色=0分,呈淡黃色=1分,呈黃色=2分,呈棕黃色=3分。最終免疫評分=染色百分比評分×染色強度評分,0～4分納入HMBOX1低表達組;6～9分納入 HMBOX1高表達組[6]。

1.3 臨床資料收集及隨訪

收集所選取的96例結直腸癌患者的性別、年齡等一般臨床資料,采用 TNM分期(第8版)[8]對術后所得的病理組織切片進行評估確定各患者腫瘤TNM 分期及分級。在患者術后出院,采取門診或電話方式對患者病情進行持續跟蹤,隨訪頻次為3～6個月/次,隨訪時間為5年。

1.4 統計學分析

使用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計數資料采用 [n(%)]表示,組間比較采用獨立樣本χ2檢驗;采用交叉列聯表分析結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達的相關性;生存時間采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank法比較兩組患者的生存率;Cox回歸綜合生存分析影響患者預后的危險因素,分析結直腸癌患者預后差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1的表達情況

免疫組化結果顯示,HMGB1與HMBOX1在細胞核與細胞質中均有表達,在個別正常的結直腸組織中弱表達,但在結直腸癌組織中表達量升高,免疫組化染色呈陽性。依據免疫組化結果將96例結直腸癌患者分為蛋白高表達組與低表達組,其中HMGB1高表達組60例、低表達組36例;HMBOX1高表達組55例、低表達組41例。見圖1。

2.2 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達與臨床病理特征的關系

結直腸癌患者中低分化程度者HMGB1高表達率較高(P<0.05),不同性別、年齡、原發位置、TNM分期、T分類、N分類等患者HMGB1高表達率比較,差異均無統計學意義(P>0.05);HMBOX1高表達與患者年齡、結直腸癌TNM分期及分化程度有關,其中年齡越低、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ及分化程度為低分化者HMBOX1高表達率較高(P<0.05),不同性別、原發位置、T分類、N分類、M分類HMBOX1高表達率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達的相關性

采用交叉表分析結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達的相關性。結果顯示,結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1均高表達占73.33%,HMGB1與HMBOX1均低表達的占69.44%,(r=0.419,P<0.05),因此,結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達相關。見表2。

表1 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達與臨床病理特征的關系 [n(%)]

表2 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達的相關性[n(%)]

2.4 結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1表達與患者預后間的關系

生存分析結果顯示,HMGB1高表達組第3、5年的總生存率分別為:56.7%、33.3%,HMGB1低表達組第3、5年的總生存率分別為:80.6%、55.6%;HMGB1高表達組第3、5 年的無瘤生存率分別為:36.7%、33.3%,HMGB1低表達組第3、5年的無瘤生存率分別為:61.1%、55.6%,均高于HMGB1高表達組(χ2=5.415,4.571,P<0.05);HMBOX1高表達組第3、5年的總生存率分別為:50.9%、27.3%,HMBOX1低表達組第3、5年的總生存率分別為:85.4%、61.0%,均高于HMBOX1高表達組(χ2=12.363,10.978,P<0.05);HMBOX1高表達組第3、5年的無瘤生存率分別為:28.1%、27.3%,HMBOX1低表達組第3、5年的無瘤生存率分別為:68.3%、60.4%,均高于HMBOX1高表達組(χ2=14.540,10.978,P<0.05)。見圖2。

2.5 結直腸癌患者總生存時間的危險因素分析

單因素分析結果顯示,TNM分期為Ⅲ～Ⅳ、T分級為T3～T4、N分級為N2、HMGB1高表達與HMBOX1高表達均為結直腸癌患者總生存時間的影響因素(P<0.05);多因素分析結果顯示,T分級為T3～T4、N分級為N2與HMBOX1高表達為結直腸癌患者總生存時間的獨立預測因子(P<0.05)。見表3。

表3 單因素和多因素Cox 回歸綜合生存分析

3 討論

現代腫瘤學認為[9],結直腸癌的發病主要與患者的年齡、生活方式、環境、飲食結構、遺傳因素等相關。在多種因素的相互作用下,原發灶部位細胞由于原癌基因的激活、抑癌基因的抑制、DNA甲基化及錯配修復等機制發生癌變[10],在該癌變過程中,多種關鍵因子表達異常,參與調控癌細胞的增殖與遷移。本研究通過免疫組化法檢測各患者結直腸癌組織及遠端結直腸組織HMGB1與HMBOX1的表達,分析結直腸癌患者預后差異,為臨床結直腸癌的治療與預后評估提供一定的理論基礎。

HMGB1是一組非組蛋白,可參與腫瘤的形成與機體的炎性反應、細胞增殖、分化及遷移等。低表達HMGB1可有效促進結直腸癌細胞的遷移和侵襲能力以及上皮-間質化,具有作為臨床結直腸癌治療的潛在靶點和指標。相關研究[11]表明,結直腸癌患者癌組織中HMGB1的表達與結直腸癌組織學分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移明顯相關,且HMGB1陽性表達患者的生存時間相對縮短。本研究結果顯示,HMGB1在結直腸癌組織中的表達水平較正常的結直腸組織升高,且HMGB1高表達與患者結直腸癌分化程度相關(P<0.05),HMGB1高表達組第3、5年的總生存率及無瘤生存率均低于HMGB1低表達組,與已有研究[11]結果相符。其機制可能為HMGB1高表達能夠一定程度影響GSK3β的活化,使GSK3β下游靶基因c-Myc靶向調節E-鈣粘蛋白,促進腫瘤細胞的遷徙和轉移[12],加速腫瘤進展,最終導致患者生存率降低。

HMBOX1可參與DNA損傷修復,是該過程中的關鍵轉錄抑制因子,可表達于機體多種正常組織中,但具有不同的表達模式和異質性,同時在胃癌組織[13]、肝癌組織、卵巢癌中均有表達。相關研究[14]表明,HMBOX1的表達水平與肝癌臨床TNM分期呈負相關。HMBOX1可增加內源性自噬標志物 LC3 II/LC3 I比率,抑制p38/AKT/mTOR通路。此外,HMBOX1過表達還可抑制癌癥干細胞CD133、KLF4、ESG1和SOX2等特異性基因,使其表達下調。同樣有研究[15]表明,HMBOX1在卵巢癌組織和卵巢癌細胞系中的下調,可抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。有效下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,上調促凋亡調節蛋白Bad、Bax的表達和凋亡執行者Caspase-3及P53的表達。本研究顯示,HMBOX1在結直腸癌組織中的表達水平較正常的結直腸組織升高(P<0.05),HMBOX1高表達與年齡、患者結直腸癌TNM分期及分化程度相關(P<0.05)。HMBOX1高表達組第3、5年的總生存率及無瘤生存率低于HMBOX1低表達組,與已有研究[16]結果相符。同時本研究分析發現結直腸癌組織中HMGB1與HMBOX1高表達相關(P<0.05)。且Cox回歸分析結果顯示,HMBOX1高表達為結直腸癌患者總生存時間的獨立預測因子。推測HMBOX1高表達可能促進癌細胞增殖,抑制癌細胞的凋亡,促進病灶生長,最終加速腫瘤的復發與生存時間的縮短。

綜上,HMGB1高表達與患者結直腸癌分化程度相關,HMBOX1高表達與患者年齡、結直腸癌TNM分期及分化程度相關,且HMGB1與HMBOX1的高表達具有相關性,其高表達時患者生存時間減少,可作為患者術后預后評估的重要指標。但本研究中所選取的樣本量較少,對于HMGB1與HMBOX1表達的相關性、與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性及對結直腸癌患者總生存時間的危險因素分析均缺乏較強的說服力,且免疫組化檢測HMGB1與HMBOX1表達量不夠準確,之后將擴大樣本量及運用酶聯免疫吸附或蛋白免疫印跡等更為準確的蛋白檢測方法進行優化,以此研究為基礎做更加深入的研究。