外周血凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態性在易栓癥反復自然流產中的診斷價值

高翔,朱云霞,孟君,張雙霞,熊霞鸝,張志紅,馬曉鵬,王金花

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院產科,北京 100069)

易栓癥孕婦胎盤內凝血和纖溶平衡狀態的失調,及絨毛微小血管和子宮螺旋動脈病變率的增加,會提高胎盤血栓和梗阻的風險,導致反復自然流產[1-2]。葉酸為B族維生素,參與DNA甲基化、合成及其它重要代謝反應,因而孕婦體內葉酸的代謝失調是導致反復流產的原因之一[3-4]。亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase,MTRR)是兩種重要的葉酸代謝酶,它們能夠調節機體中維生素B9和B12的表達,維持體內同型半胱氨酸水平,防止高凝狀態的發生[5]。缺乏葉酸和維生素B12的孕婦,體內同型半胱氨酸過多,損傷血管內皮功能,促進血管平滑肌細胞增殖,最終造成高凝狀態。本研究旨在探討外周血凝血指標水平、MTHFR和MTRR基因多態性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年3月至2022年11月首都醫科大學附屬北京佑安醫院收治的98例反復自然流產患者(流產次數≥2次)的非妊娠婦女為研究對象;另選取同時期行孕前檢查的健康非妊娠婦女80名作為對照組。本研究經醫院倫理委員會批準。納入標準:(1)觀察組婦女連續自然流產次數≥2次,且其生殖系統解剖學正常,確診為易栓癥[6];(2)患者的認知正常,可配合相關檢查;(3)患者自愿參與此次研究,并簽署知情同意書。排除標準:(1)合并有甲狀腺疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病或血栓類疾病者;(2)不明原因自然流產者;(3)患者有吸煙、酗酒等嗜好;(4)入組前服用過抗凝藥物者。

1.2 方法

(1)根據患者的就診資料,整理記錄每位患者的年齡、民族、居住地、體質量指數(BMI)、人工助孕史。(2)采集所有入選者的晨起外周靜脈血3 mL,置于抗凝試管中保存。后采用全自動血細胞分析儀檢測D-二聚體(D-D)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)及凝血活酶時間(aPTT)。(3)采用熒光定量PCR技術,檢測MTHFR基因C677T、A1298C和MTRR基因A66G位點單核苷酸多態性(single nucleotide polymor-phism,SNP)分型。每個反應體系10 μL,包含2×Taqman Universal Master Mix 5 μL、DNA模板1 μL、去離子水3.5 μL和20×Taqman-MGB探針0.5 μL,進行PCR擴增,通過熒光定量PCR儀讀取終點熒光,確定樣本基因分型結果。其中MTHFR C677T基因位點引物:F序列為AAGCTGCGTGATGATGAAATCG,R序列為CTCCCGCAGACACCTTCTCC。MTHFR A1298C基因位點引物:F序列為AACGAAGACTTCAAAGACACTT,R序列為CTTCACTGGTCAGCTCCTCCCC。MTRR A66G引物:F序列GGCAAAGGCCATCGCAGAAGAAAT,R序列TGTGAGCAAGCTGTGGTACAT。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組對象一般資料比較

兩組對象年齡、民族、BMI、居住地及人工助孕史比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組對象一般資料比較

2.2 兩組對象血清凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態性比較

兩組對象外周血凝血指標PT、TT、aPTT比較,差異均無統計學意義(P>0.05),觀察組血漿D-D高于對照組(P<0.05)。Hardy-Weinberg平衡定律檢驗結果顯示,入組婦女的三種基因多態性都符合遺傳平衡。觀察組人群的MTHFR A1298C、MTHFR C677T及MTRR A66G的χ2值為1.667、3.294、3.248(P>0.05);對照組基因型的χ2值分別為1.563、0.061、1.098(P>0.05)。兩組MTHFR A1298C、MTRR A66G的基因型比較差異不具有統計學意義(P>0.05),而觀察組MTHFR C677T的TT型基因及等位基因T表達高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組對象血清凝血指標、MTHFR和MTRR基因多態性比較

2.3 血漿D-D、MTHFR C677T基因型與易栓癥自然流產的Logistic回歸分析

血漿D-D高表達、MTHFR C677T基因型TT是易栓癥反復自然流產(易栓癥反復自然流產=1,健康=0)的獨立危險因素(P<0.05)。見表3及表4。

表3 多因素Logistic回歸分析的變量賦值表

表4 易栓癥自然流產發生影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

引起反復自然流產的因素多樣,而易栓癥是其重要原因之一[7]。易栓癥可分為獲得性和遺傳性兩大類,遺傳性易栓癥流產是由產婦凝血基因突變或凝血基因缺陷而導致的胎盤微循環障礙引起,而獲得性則是因為高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥和磷脂抗體的存在[8]。外周血凝血指標可直接反應產婦的凝血功能[9],同時MTHFR和MTRR基因的SNP分型與葉酸代謝有關[10-11],或可協助預估易栓癥性反復自然流產發生風險。

本研究表明,兩組外周血PT、aPTT、TT無差異,但血漿D-D水平在反復流產患者中有升高。有關研究[12]表明,血漿D-D升高可能是復發流產的危險因素之一,可能是由于血小板在受到內源或外源性刺激物作用下被激活,導致缺血或血栓,影響血液循環。血漿D-D水平升高是血栓形成和高凝狀態的重要指標[13],它通過纖維蛋白原凝血酶轉變成交聯纖維蛋白單體,再由活化因子XⅢ作用形成交聯纖維蛋白,最后被纖維酶水解產生[14-15],因此,它的升高可能暗示身體存在明顯的繼發性纖溶過程。因此本研究認為,監測血漿D-D的表達有利于易栓癥反復自然流產的早期診斷。

MTRR和MTHFR是葉酸代謝過程中的關鍵酶,而其位點基因突變會導致酶活性降低。本研究通過使用熒光定量PCR技術檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點及MTRR基因A66G位點的SNP分型,結果發現,兩組MTHFR A1298C、MTRR A66G基因型并無差異,但兩組的MTHFR C677T基因多態性存在統計學差異。在觀察組中,MTHFR C677T位點TT基因型、等位基因T占比為28.57%和48.98%,分別均高于對照組的占比12.50%和36.25%,前者較高。這可能是因為MTHFR C677T位點C被T取代后,編碼的丙氨酸被纈氨酸代替,從而導致酶的耐熱性和活性下降,導致血漿中Hcy的異常表達。在潘銀平等[16]的研究中也認為MTHFR C677T中的TT基因型會增加不良妊娠風險,本研究結果與其一致。也有研究[17]表明,MTRR、MTHFR基因型均可影響妊娠結局,MTHFR C677T與A1298C協同作用也能導致酶活性減弱,使得Hcy濃度增加,引發流產及出生缺陷。在國外學者研究[18]中,MTRR、MTHFR基因多態性被證實還可影響唐氏綜合征等多種疾病的發生風險。可見,MTHFR和MTRR基因的多態性可能導致葉酸代謝的異常,從而引發不同的疾病。因此,通過檢測MTHFR基因C677T、A1298C位點和MTRR基因A66G位點的SNP分型,可以幫助臨床醫生進行更有針對性的疾病干預,有效地改善母嬰結局。本研究還顯示,Logistic分析表明MTHFR C677T位點TT基因型及血漿D-D均為易栓癥反復自然流產發生的影響因素,可協助臨床評估妊娠風險。

綜上,MTHFR基因多態性、外周血D-D表達影響易栓癥反復自然流產的發生,而MTRR基因型影響并無差異。但需要注意的是,易栓癥流產是受多種因素影響的綜合結果,由于條件限制,本研究的入選樣本數量較少,因此研究結果可能存在一定的誤差。未能控制其他變量也是本研究的另一個限制。在今后的研究中,會進一步擴大樣本量,完善研究方案,提高結果的科學性。