玉米種衣劑在土壤中的殘留動態及對土壤酶活性和可培養細菌的影響

劉亞冬， 呂陳生， 申鴻， 武奕彤， 李開葉

1. 西南大學 資源環境學院，重慶 400715；2.重慶市農業資源與環境研究重點實驗室，重慶 400715

新煙堿類殺蟲劑和三唑類殺菌劑因其廣譜高效的殺蟲、 殺菌效果, 被廣泛應用于全球農業和公共衛生領域, 尤其是用于種衣劑處理[1-2]． 然而, 已有的研究發現, 該內吸性農藥在環境介質和農副產品中被高頻檢出, 嚴重威脅環境安全和人類健康[3-6]． 噻蟲嗪為第二代新煙堿類殺蟲劑, 因其特殊內吸性, 容易被環境介質中的動植物攝入, 對非靶標昆蟲[7-8]、 水生無脊椎動物[9-10]、 食蟲鳥類[11-12]、 人類[13-14]造成有害影響, 甚至破壞食物鏈及生態環境[15], 其結構圖如圖1所示． 苯醚甲環唑屬于三唑類殺菌劑, 易殘留于土壤中． 殘留于土壤中的苯醚甲環唑[16-18]影響土壤微生物多樣性[19-20]、 土壤酶活性[21-22]和土壤微生物數量[23]． 因此, 開展種衣劑對土壤酶活性和可培養細菌影響的研究對于土壤生態安全保護具有重要意義．

圖1 噻蟲嗪和苯醚甲環唑結構式

目前國內外對內吸性農藥的生態毒理學研究主要集中于農藥在土壤中的最終殘留量, 以及對相關生物的直接負面影響等方面, 但是針對其在土壤中的動態遷移、 殘留及其對土壤微生態環境影響的研究還較少． 土壤的物質循環、 能量流動及信息傳遞與土壤微生態環境密切相關, 土壤微生態環境良好是保證土壤物質正常循環、 土壤養分正常供應的前提[24-27]． 此外, 實際農業生產中不止用單一農藥作為種子包衣劑, 通常將殺蟲劑和殺菌劑聯合施用以達到對作物更好的保護作用, 因此有必要探究復合農藥對土壤微生態環境的影響． 本研究以噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑作為2種玉米種衣劑施用, 通過田間試驗, 監測內吸性農藥在土壤中的殘留動態, 分析土壤中可培養微生物的數量及土壤相關酶活性的狀態, 揭示噻蟲嗪和苯醚甲環唑對土壤微生態的潛在影響, 以期為噻蟲嗪和苯醚甲環唑在種衣劑方面的安全使用提供評價依據．

1 材料與方法

1.1 試驗場地與材料

試驗地點: 試驗于2020年5-7月在重慶市合川區渭沱鎮西南大學試驗農場基地(30°0′N, 106°7′E)進行, 該地區屬亞熱帶季風氣候, 5-7月的月均氣溫為26 ℃, 月均降水量為 208 mm． 土壤類型為沖積土, 基本性質為: pH值為8.4, 有機質質量分數為21.5 g/kg, 全氮質量分數為1.3 g/kg, 堿解氮質量分數為51.2 g/kg, 有效磷質量分數為28.7 mg/kg, 速效鉀質量分數為89.0 mg/kg．

供試農藥: 本試驗使用農藥懸浮劑噻蟲嗪和混劑噻蟲嗪-苯醚甲環唑, 由先正達公司生產, 農藥登記號分別為PD20160110和PD20161551． 按說明書推薦劑量(600 mL/100 kg種子)在實驗室進行玉米種子包衣．

供試玉米: 品種為“黑糯100”, 由重慶市農業科學院種子中心提供．

1.2 試驗設計

采用田間試驗研究噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑作為玉米種衣劑對土壤微生態環境的影響． 將667 m2試驗田平均劃分為3個大區, 每個大區播種0.5 kg玉米種子, 每hm260 000株玉米． 3個大區分別為對照組(CG), 噻蟲嗪組(Z)和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑組(ZW)． 每個大區包括4個小區, 共計12個試驗小區． 其他種植管理同當地玉米種植技術一致．

1.3 土壤樣品采集

玉米種子于2020年5月10日播種, 等待采樣． 采樣時間為5月27日(18 d, 苗期階段)、 6月10日(32 d, 拔節期)、 6月19日、 6月25日(47 d, 抽穗期)、 7月4日、 7月12日(64 d, 灌漿期)、 7月22日(74 d, 乳熟期)． 隨機抽取樣本土壤, 采集根際土和非根際土, 采集的土壤一部分在試驗室自然陰干, 用2 mm的篩子過篩, 放于-20 ℃的環境中等待農藥殘留檢測; 另一部分放在液氮環境中保存, 運回試驗室, 在-80 ℃條件下保存, 然后進行相關指標的測定． 其中, 5月27日的非根標土因野外不可控因素遺失．

1.4 測定方法

1.4.1 土壤農藥殘留測定

準確稱取10.00 g 土壤樣品置于錐形瓶中, 加入10 mL純水后靜置水化1 h, 加入20 mL乙腈, 180 r/min搖床振蕩1 h, 稱好5～7 g NaCl置于100 mL離心管中, 將上清液倒入其中, 錐形瓶中再加入20 mL乙腈, 再180 r/min搖床振搖1 h, 上清液倒入上述100 mL離心管中, 5 000 r/min 離心機離心5 min, 取2 mL上清液, 過0.22 μm濾膜, 置于進樣小瓶中, 進樣小瓶置于-20 ℃冰箱中, 送往科研監測所進行分析[28]．

1.4.2 土壤酶活性測定

(1) 土壤脫氫酶

使用Solarbio?土壤脫氫酶(S-DHA)活性檢測試劑盒檢測． 具體步驟為: 測定管和對照管各加入0.1 g土樣, 對照管加入試劑二1 mL, 測定管中加入試劑一0.5 mL和試劑二0.5 mL, 混勻后37 ℃暗培養6 h后立即冰浴5 min, 分別加入0.5 mL試劑三． 數次震蕩后, 37 ℃保溫10 min, 1 200 rpm、 4 ℃離心機離心5 min, 取上清液置于玻璃比色皿中, 用分光光度計在波長為485 nm條件下測定[29]．

(2) 土壤過氧化氫酶

使用Solarbio?土壤過氧化氫酶(S-CAT)活性檢測試劑盒檢測． 具體步驟為: 無基質管和測定管各加入0.1 g土樣, 測定管和無土管分別加入試劑一1 000 μL, 無基質管加入雙蒸水1 000 μL, 25 ℃振蕩培養20 min后, 三管分別加入試劑二25 μL, 混勻后于8 500 rpm、 25 ℃離心機離心5 min, 取全部上清液, 分別加入試劑三120 μL并混勻, 用分光光度計在波長為240 nm條件下測定[29]．

1.4.3 土壤可培養細菌數量

采用稀釋平板法測定土壤可培養細菌數量[30], 具體步驟為: 先測定土壤樣品水分系數, 后稱取5.00 g土樣, 放入裝有45 mL無菌水的三角瓶中, 振蕩20 min, 使土樣分布均勻, 土樣溶液靜置10 min, 成為土壤懸浮液; 取1 mL土壤懸浮液, 置于裝有9 mL無菌水的試管中, 用振蕩器使土壤懸浮液均勻分布, 用十倍稀釋法將菌懸液稀釋成10-4的梯度． 把稀釋好的菌懸液接種到配置好的培養基中, 倒置 30 min． 置于37 ℃的恒溫培養箱中12 h, 取數量適中、 菌落分布均勻的培養基計數．

1.5 數據處理方法

試驗結果表示為平均數±準偏差(Mean±SD), 采用SPSS 21.0軟件進行數據統計, 采用單因素方差分析, 顯著水平設為0.05． 采用Origin 2018軟件進行作圖．

2 結果與討論

2.1 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑在土壤中殘留隨時間的變化情況

對0～10 cm深度的土壤中農藥殘留情況進行了測定, 結果如表1所示． 單施噻蟲嗪處理, 6月19日前可檢測到噻蟲嗪, 之后土壤中均未檢測到農藥的殘留． 在5月27日、 6月10日及6月19日土壤中噻蟲嗪總殘留量分別為0.018,0.035,0.054 μg/g, 結果表明, 6月19日之前, 隨著玉米植株的生長, 土壤中農藥殘留量逐漸增加． 施用噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理, 5月27日、 6月10日、 6月19日均可檢測到噻蟲嗪, 殘留量分別為0.036,0.024,0.019 μg/g, 其余時間均低于檢出限, 說明玉米生長前期隨著時間推移土壤中噻蟲嗪殘留量逐漸減少, 而苯醚甲環唑在玉米各個生長時期均低于檢出限．

表1 不同種衣劑處理下土壤農藥殘留情況 μg·g-1

單施噻蟲嗪時, 噻蟲嗪在土壤中的殘留量從5月27日至6月19日逐漸上升, 可能是因為玉米種子由種衣劑包裹, 種衣劑隨玉米種子的生長緩慢釋放, 致使土壤中噻蟲嗪殘留量逐漸增大． 噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理玉米生長前期土壤噻蟲嗪殘留量減少, 可能是因為苯醚甲環唑的存在可導致噻蟲嗪在前期的釋放速率小于其分解速率和被植物吸收速率． 由本試驗結果可知, 在玉米生長初期種衣劑中的農藥絕大部分留在了土壤, 而不是被植物吸收． Wood等[31]研究也指出包衣劑中的有效成分只有約5%能被作物吸收, 其余部分可能會殘留到土壤中． 另外, 吳俊學[32]通過溫室土柱試驗證明僅有不到10%的農藥從種子中被作物體系吸收, 有大于90%的農藥從種子轉移到了土壤中． Anderson等[33]也報道, 根據施用方法和作物類型的不同, 僅有1.6%～28.0%的新煙堿殺蟲劑被植物吸收, 而剩余的將進入土壤或滲透至地下水中． 因此殘留在土壤中的農藥會隨著降雨及玉米植株的生長, 在土壤中發生一系列的降解以及遷移的行為, 從而會對土壤微生態環境構成潛在的危害．

2.2 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑對土壤酶活性的影響

2.2.1 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑對土壤脫氫酶活性的影響

圖2顯示了根際土的脫氫酶活性變化情況． 隨著玉米的生長, 對照和種衣劑處理土壤脫氫酶活性均有降低的趨勢, 5月27日(苗期)脫氫酶活性最大, 7月22日(乳熟期)脫氫酶活性最小． 在灌漿期前根際土土壤脫氫酶的活性呈下降趨勢, 灌漿期后逐步恢復平穩, 原因可能是在種植玉米初期耕作活動比較頻繁, 可以為土壤微生物帶來生長繁殖所需的營養物質和氧氣條件[34-35], 所以前期脫氫酶活性較高, 但土壤微生物在后期溫度升高和農業活動減少的情況下生存環境轉變, 能產生脫氫酶的微生物也受到影響, 進而導致土壤脫氫酶活性降低． 土壤脫氫酶在后期活性較穩定, 可能是因為很多耐受性厭氧微生物和兼性厭氧微生物的大量繁殖, 保證了土壤脫氫酶的平衡． 非根際土的脫氫酶活性比根際土酶活性低, 與根際土相似, 總體呈現先明顯降低后趨于平穩的趨勢, 單施噻蟲嗪處理和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混施處理土壤脫氫酶活性均比對照組處理高．

誤差線代表平均值±標準偏差． 不同的小寫字母表示同一時間不同處理之間差異有統計學意義(p<0.05), 不同的大寫字母表示同一處理不同時間之間差異有統計學意義(p<0.05)． 下同．圖2 不同農藥處理下的土壤脫氫酶活性

噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理較對照組相比, 根際土土壤脫氫酶的活性分別提高0.27%～11.94%和0.73%～14.51%, 非根際土土壤脫氫酶活性分別提高3.1%～15.53%和4.69%～16.14%． 種衣劑處理能提高土壤脫氫酶活性可能是因為低濃度的農藥會促進土壤脫氫酶的生長繁殖． 而土壤脫氫酶的活性與土壤微生物的狀態密切相關, 可以作為土壤污染物降解程度和微生物生存狀況的指標[36], 由此推測低濃度的農藥可能是通過促進微生物的生長來促進脫氫酶活性升高的． 土壤酶還能和農藥發生化學反應, 分解轉化土壤中的有機污染物, 使農藥對植物生長和對土壤健康的影響程度降低[37]． 隨時間推移, 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑不斷被土壤微生物分解, 農藥殘留量逐漸降低, 對土壤脫氫酶活性的促進作用也逐漸降低． 土壤中農藥殘留量的降低使其對土壤微生物的影響減弱, 但農藥施用量少, 且前期可能是以農藥促進產脫氫酶的微生物生長繁殖機制為主． 在兩種機制的作用下, 農藥對土壤脫氫酶的促進作用隨農藥殘留的減少而減弱, 因此后期施用農藥處理和對照處理的脫氫酶活性趨于相同．

2.2.2 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑對土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶活性如圖3所示, 對照組根際土過氧化氫酶活性隨玉米的生長呈先上升后平穩的趨勢, 而兩種種衣劑處理根際土過氧化氫酶活性先下降后趨于穩定． 對照組過氧化氫酶的活性先顯著升高后趨于平穩, 是因為玉米根系活力隨玉米植株的生長而增強, 產生更多促進有機質降解的分泌物, 使得微生物的活動效率提高, 進而使土壤過氧化氫酶的活性增大． 為了給玉米的生長提供保證, 試驗組與對照組都施加了同樣的肥料, 而過氧化氫酶的活性與土壤肥力有良好的相關關系, 隨著玉米的生長發育, 土壤過氧化氫酶的活性也趨于穩定． 非根際土的過氧化氫酶活性與根際土變化趨勢相似, 隨著時間的推移, 施用種衣劑處理后土壤過氧化氫酶活性先提高后逐漸與對照組水平一致, 非根際土過氧化氫酶活性比根際土低．

圖3 不同農藥處理下的土壤過氧化氫酶活性

相比對照處理, 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理使土壤過氧化氫酶的活性明顯提高, 根際土分別提高1.10%～37.13%和0.64%～36.55%, 非根際土分別提高0.32%～31.68%和2.47%～29.94%, 與農藥對土壤脫氫酶的影響相似． 可能是由于低濃度的農藥對土壤過氧化氫酶的活性有促進作用． 土壤過氧化氫酶可以作為土壤好氧微生物的生存狀況指標, 可以抑制對生物體有害的過氧化氫的含量, 過氧化氫酶的活性與土壤微生物的活性和數量等有密切的關系[38]． 低濃度的農藥可能是通過產生大量的過氧化氫, 同時促進好氧微生物的生長繁殖, 進而使土壤過氧化氫酶的活性增加． 農藥的殘留隨玉米植株的生長發育逐漸減少, 對過氧化氫酶的促進作用也逐漸變弱, 因此施用農藥的處理與對照組的處理過氧化氫酶的活性后期趨于相同． 而單施噻蟲嗪和施用噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑2種處理的土壤過氧化氫酶活性并無顯著差異, 可能是因為土壤中苯醚甲環唑在玉米的整個生長期間都在檢出限以下, 殘留量低, 且噻蟲嗪與苯醚甲環唑無明顯的聯合毒性, 所以對土壤過氧化氫酶的活性影響不大．

2.3 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑對土壤可培養細菌數量的影響

由圖4可知, 根際土可培養細菌數量隨著玉米的生長呈降低趨勢, 相比對照處理, 2種種衣劑處理均能減少土壤可培養細菌的數目, 隨著時間的推移, 降低效果逐漸減弱, 乳熟期(7月22日)恢復與對照相同水平． 非根際土的可培養細菌數量在玉米植株的整個生長期內變化不大, 且比根際土低了一個數量級, 可能是因為非根際土距離玉米植株根系較遠, 所受影響較小． 對照組的根際土可培養細菌數量變化趨勢為先升高后降低, 在玉米拔節期(6月10日)時達最大值, 可能是因為玉米植株在生長過程中, 根部吸收土壤養分的同時也分泌了可以為土壤微生物提供養分的物質, 玉米植株生長前期根系發育較快, 釋放的分泌物多, 從而使土壤可培養細菌數量增加, 而玉米植株生長中后期根系的生長速度減慢, 釋放的分泌物減少, 土壤可培養細菌數量也減少．

圖4 不同農藥處理下的土壤可培養細菌數量

相比對照處理, 玉米植株生長前期, 單施噻蟲嗪和施用噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑2種處理的土壤可培養細菌數量均明顯降低, 可能是由于低濃度的農藥施用會抑制土壤可培養細菌數量; 也可能是目前通過試驗室人工培養的方式分離的可培養細菌不足土壤細菌總量的1%[39], 這兩種農藥的施用對其他不可培養的微生物的生長繁殖有促進作用, 使土壤可培養細菌的生存資源減少, 進而使土壤可培養細菌數量降低． 兩種情況均可能改變土壤微生物結構, 影響土壤微生態環境狀況． 農藥殘留量隨時間的推移逐漸減少, 土壤可培養細菌的數量也恢復至對照水平． 相比噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理, 單施噻蟲嗪處理在玉米植株生長前期土壤可培養細菌數量高, 可能是因為苯醚甲環唑對土壤可培養細菌有抑制作用, 但苯醚甲環唑施用量較少且隨時間推移殘留量減少, 因此后期2種處理的土壤可培養細菌數量差別不大．

3 結論

單施噻蟲嗪及噻蟲嗪-苯醚甲環唑混合施用時土壤中噻蟲嗪的殘留主要在0～10 cm土層處, 研究期內噻蟲嗪在土壤中的最高質量分數分別為0.068 μg/g(2020年6月19日, 單施)和0.036 μg/g(2020年5月27日, 混劑), 苯醚甲環唑在各時期各土壤深度均未達到檢出限．

與對照組相比, 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理對土壤脫氫酶和過氧化氫酶的活性均有激活作用, 根際土土壤脫氫酶和過氧化氫酶的活性分別提高0.27%～11.94%,0.73%～14.51%和1.10%～37.13%, 0.64%～36.55%． 隨玉米植株的生長, 土壤酶活性均恢復到與對照組同一水平．

玉米生長前期, 噻蟲嗪和噻蟲嗪-苯醚甲環唑混劑處理對土壤可培養細菌均有明顯抑制作用, 隨玉米植株的生長, 抑制作用逐漸減弱直至乳熟期恢復與對照組同一水平．