芪地糖腎方對(duì)糖尿病腎病小鼠腎臟病變及血清Klotho、MMP-9/TIMP-1的影響

史 揚(yáng),周 盈,安至超,郭 燕,鄭毅成,董昭熙,柳紅芳

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)房山醫(yī)院,北京 102400)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的慢性、致死性并發(fā)癥之一,以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度堆積進(jìn)而導(dǎo)致腎小球基底膜增厚為首現(xiàn)的關(guān)鍵病理改變[1]。目前缺乏對(duì)抗DN進(jìn)展的有效治療手段,其引起的終末期腎臟病已成為世界難題。高糖病理環(huán)境下,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)/組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)酶系調(diào)節(jié)系統(tǒng)作用失常以及Klotho等抗纖維化因子表達(dá)的下調(diào)是ECM過量積聚的重要原因[2-3]。芪地糖腎方是北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院柳紅芳教授的經(jīng)驗(yàn)方,具有填補(bǔ)腎精、通絡(luò)除痹之效,可降低尿蛋白,改善腎臟微炎癥狀態(tài),下調(diào)纖維化因子表達(dá),保護(hù)腎功能[4-8]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察DN小鼠血清Klotho、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、組織金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)及腎臟病理形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的變化,進(jìn)一步探究了芪地糖腎方的作用機(jī)制,以期為該方的臨床應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF清潔級(jí)雄性db/db小鼠36只,8周齡,體重(30±6)g;同周齡SPF清潔級(jí)雄性db/m小鼠12只,體重(20±5)g。小鼠均由江蘇卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2016-0010。所有小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障級(jí)動(dòng)物室,自由進(jìn)食水,晝夜交替光照12 h,溫度(22±2)℃,濕度(55±10)%。本研究已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物福利與倫理委員會(huì)的審查(20-25)。

1.2藥物與試劑 芪地糖腎方由熟地黃、生黃芪、炒芡實(shí)、山萸肉、水蛭、熟大黃、白花蛇舌草組成,由北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院藥房制作成顆粒劑。纈沙坦膠囊,北京諾華有限公司生產(chǎn)。按照小鼠與人等效劑量(9∶1)計(jì)算小鼠芪地糖腎顆粒每日用量為3.33 g/kg,纈沙坦膠囊每日用量為10.29 mg/kg(用時(shí)打開膠囊稱重)。小鼠血清Klotho、MMP-9、TIMP-1及尿白蛋白檢測(cè)ELISA試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(產(chǎn)品編號(hào):ml057910,ml037717,ml037716,ml063626)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)所有小鼠進(jìn)行6周適應(yīng)性喂養(yǎng),14周齡時(shí)將db/db小鼠隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組、芪地糖腎方組,每組12只;db/m小鼠12只作為正常組。芪地糖腎方組給予3.33 g/kg芪地糖腎顆粒水溶液灌胃,纈沙坦組給予10.29 mg/kg纈沙坦水溶液灌胃,正常組、模型組給予等量的生理鹽水灌胃,均1次/d,連續(xù)灌胃12周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1尿蛋白水平 于各組小鼠末次灌胃后,禁食不禁水12 h,收集尿液,采用ELISA法檢測(cè)尿微量白蛋白水平,計(jì)算12 h尿白蛋白水平(12 h尿白蛋白水平=尿微量白蛋白水平×12 h總尿量)。

1.4.2腎重體重比值 收集尿液后稱各組小鼠體重,以2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠,取左腎,稱重量,計(jì)算腎重體重比值。

1.4.3血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平 麻醉后摘眼球取血,4 ℃下3 000 r/min離心15 min,取上層血清,采用ELISA法檢測(cè)血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平,計(jì)算MMP-9/TIMP-1。

1.4.4腎臟組織超微病理結(jié)構(gòu) 取右腎,沿冠狀面剖開,切至1 mm3大小,放入2.5%戊二醛的避光西林瓶中固定24 h后制作電鏡切片,于電鏡下觀察腎臟超微病理結(jié)構(gòu);采用Image J軟件進(jìn)行電鏡圖像分析,每組小鼠于10 000倍下各采集10個(gè)視野,每個(gè)視野隨機(jī)測(cè)量5處腎小球基底膜厚度,計(jì)算平均值。

1.4.5腎臟組織病理形態(tài) 取經(jīng)4%甲醛固定24 h后的腎組織,常規(guī)脫水,石蠟包埋,使用切片機(jī)制作4 μm厚切片,分別進(jìn)行HE染色及Masson染色,于光鏡下觀察腎臟病理形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠12 h尿白蛋白水平及腎重體重比值比較 與正常組比較,模型組、纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠12 h尿白蛋白水平均明顯升高(P均<0.05),模型組、纈沙坦組小鼠腎重體重比值均明顯降低(P均<0.05);纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠12 h尿白蛋白水平均明顯低于模型組(P均<0.05),芪地糖腎方組小鼠腎重體重比值明顯高于模型組(P<0.05),纈沙坦組與芪地糖腎方組12 h尿白蛋白水平、腎重體重比值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和糖尿病腎病各組小鼠12 h尿白蛋白水平及腎重體重比值比較

2.2各組小鼠血清Klotho、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比較 與正常組比較,模型組小鼠血清Klotho水平明顯降低(P<0.05),血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均明顯升高(P均<0.05);與模型組比較,纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠血清Klotho水平均明顯升高(P均<0.05),血清MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1均明顯降低(P均<0.05),纈沙坦組與芪地糖腎方組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和糖尿病腎病各組小鼠血清Klotho、MMP-9/TIMP-1水平比較

2.3各組小鼠腎臟組織電鏡下表現(xiàn) 正常組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)清晰,少見足突融合,腎小球基底膜厚度為(150.94±17.89)nm,且均勻;模型組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)模糊紊亂,足突融合現(xiàn)象多見,腎小球基底膜厚度為(282.60±27.72)nm,明顯高于正常組(P<0.05);纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)較清晰有序,足突融合現(xiàn)象較少見,腎小球基底膜厚度分別為(205.32±22.81)nm、(170.08±27.69)nm,均明顯低于模型組(P均<0.05),且芪地糖腎方組明顯低于纈沙坦組(P<0.05)。見圖1。

圖1 正常組和糖尿病腎病各組小鼠腎臟組織電鏡下表現(xiàn)(×10 000)

2.4各組小鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn) 正常組小鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整、清晰,未見明顯病理改變;模型組小鼠腎臟組織可見腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚,腎小管上皮細(xì)胞呈空泡樣變性、管腔擴(kuò)張;纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠腎臟組織細(xì)胞排列較整齊,基底膜增厚及小管空泡變性等病理變化均明顯改善。見圖2。

圖2 正常組和糖尿病腎病各組小鼠腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

2.5各組小鼠腎臟組織Masson染色表現(xiàn) 正常組小鼠腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整、清晰,未見明顯藍(lán)染膠原纖維;模型組小鼠系膜基質(zhì)增生,基底膜彌漫性增厚,腎間質(zhì)可見明顯藍(lán)染膠原纖維;纈沙坦組、芪地糖腎方組小鼠腎臟組織呈現(xiàn)局灶性藍(lán)染膠原纖維沉積,纖維化面積較模型組明顯減少。見圖3。

圖3 正常組和糖尿病腎病各組小鼠腎臟組織Masson染色表現(xiàn)(×400)

3 討 論

DN是在長(zhǎng)期高糖的病理環(huán)境下,機(jī)體出現(xiàn)的慢性、不可逆的腎臟結(jié)構(gòu)及功能損害。DN早期以ECM積累為特征性病理表現(xiàn),并逐漸出現(xiàn)腎小球基底膜及系膜增厚、基質(zhì)增生,最終導(dǎo)致腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。腎小球基底膜增厚是DN最早出現(xiàn)的腎臟結(jié)構(gòu)變化,多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)該病理過程[9-10]。腎小球基底膜是腎小球毛細(xì)血管壁的關(guān)鍵組成部分,其作為腎小球內(nèi)足細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的分隔層,對(duì)于支持腎小球選擇性濾過功能有至關(guān)重要的作用[11],靶向修復(fù)腎小球基底膜的治療手段可有效減少蛋白尿并延緩腎衰竭的發(fā)生[12-14]。

目前研究認(rèn)為MMPs/TIMPs酶系調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與調(diào)控ECM的生成與降解。MMPs參與ECM的降解,正常情況下其活性較低,在組織損傷重塑及炎癥修復(fù)過程中被激活,TIMPs可抑制MMPs的活性;生理狀態(tài)下,MMPs/TIMPs處于平衡狀態(tài)以維持腎臟ECM的生理性形態(tài),保證腎小球基底膜結(jié)構(gòu)及功能正常,二者關(guān)系的失衡是ECM過量沉積的重要原因[15-16]。在MMPs/TIMPs酶系調(diào)節(jié)系統(tǒng)中,MMP-9、TIMP-1是關(guān)鍵的作用因子,TIMP-1對(duì)MMP-9有高度特異性抑制作用,二者水平與DN存在著密切關(guān)聯(lián)[17],血清MMP-9、TIMP-1水平及二者比值可反映ECM積聚情況[18]。Klotho蛋白又被稱為抗衰老抑制劑,其高表達(dá)可以抑制高糖環(huán)境下腎臟固有細(xì)胞中ECM的過度沉積[19],可通過影響炎癥、氧化應(yīng)激、纖維化等相關(guān)通路發(fā)揮抑制DN病程進(jìn)展的作用[20];其血清水平可反映腎纖維化程度,可作為糖尿病繼發(fā)腎病的早期預(yù)測(cè)因子[21-22]。

中醫(yī)認(rèn)為DN中ECM過度沉積及腎小球基底膜增厚等病理改變總因瘀滯痰毒等邪阻結(jié)腎絡(luò)所成[23]。柳紅芳教授根據(jù)臨證經(jīng)驗(yàn),認(rèn)為該病核心病機(jī)可以概括為精損絡(luò)痹[24],以“填精通絡(luò)”為核心治法自擬芪地糖腎方,臨床效驗(yàn)明確且已通過國(guó)家專利審批(專利號(hào):ZL201711097315.2)。方中以熟地黃填補(bǔ)腎精,直達(dá)病源;以生黃芪補(bǔ)氣生精,精氣共活;以炒芡實(shí)、山萸肉益腎固精;以水蛭、熟大黃、白花蛇舌草通腎絡(luò)、除痹阻以助腎精敷布;全方以填補(bǔ)腎精、祛邪通絡(luò)為大法,使腎精之中空得填,腎絡(luò)之瘀熱濕痹等邪得除,諸藥并用以達(dá)虛實(shí)并濟(jì)、標(biāo)本兼調(diào)之效。既往實(shí)驗(yàn)研究表明,該方可通過影響自噬、腸道菌群及胰島素抵抗等相關(guān)信號(hào)通路靶點(diǎn)有效降低DN動(dòng)物模型的蛋白尿,減輕腎臟纖維化程度[25-27]。

db/db小鼠是目前公認(rèn)的較為理想并具有良好穩(wěn)定性的DN動(dòng)物模型,該類小鼠在8周齡時(shí)即出現(xiàn)典型的高血糖表現(xiàn),12～14周齡出現(xiàn)腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增加等腎臟病理改變;與其他鼠系相比,db/db小鼠在高血糖影響下出現(xiàn)進(jìn)行性腎臟損害,且該鼠系的腎臟結(jié)構(gòu)變化與臨床DN患者最為相似[28-29]。故本實(shí)驗(yàn)以db/db小鼠作為DN研究模型,并選擇同窩雜合子db/m小鼠作為正常對(duì)照,從影響ECM沉積、腎小球基底膜角度探討了芪地糖腎方對(duì)DN的保護(hù)作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,模型組小鼠腎重體重比值顯著降低,芪地糖腎方組小鼠腎重體重比值回升,這可能與治療后芪地糖腎方組小鼠體重稍有下降而模型組小鼠體重持續(xù)上升有關(guān);模型組小鼠血清Klotho水平明顯降低,尿白蛋白水平及血清MMP-9、TIMP-1水平和MMP-9/TIMP-1明顯升高,纈沙坦組、芪地糖腎方各指標(biāo)均明顯改善,這與目前臨床研究結(jié)果有相似之處,但血清中MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1可能受到藥物及糖尿病其他并發(fā)癥等的影響[18],其對(duì)DN腎臟病變程度的預(yù)測(cè)作用有一定的參考價(jià)值,但尚缺乏特異性,臨床實(shí)踐中應(yīng)結(jié)合其他理化指標(biāo)綜合評(píng)估。電鏡觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)及腎臟形態(tài)顯示DN小鼠腎臟組織膠原纖維沉積、腎小球基底膜明顯增厚,纈沙坦組和芪地糖腎方組這些病理改變均較輕,且芪地糖腎方組更輕,說明纈沙坦和芪地糖腎方均可有效減少ECM沉積,抑制腎小球基底膜增厚。

綜上所述,芪地糖腎方有不亞于血管緊張素受體拮抗劑類藥物降低DN尿蛋白、抑制腎臟ECM過度沉積及腎小球基底膜增厚的作用,這種作用可能是通過影響血清Klotho蛋白水平及MMP-9/TIMP-1平衡狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的。本研究進(jìn)一步為芪地糖腎方治療DN提供了理論依據(jù),但中藥組方作用靶點(diǎn)、途徑復(fù)雜,其藥理作用機(jī)制還有待探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。