健脾活血解毒方聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙型病毒性肝炎合并非酒精性脂肪性肝病小鼠的干預(yù)作用及機(jī)制

毛垚耀,何惠昌,謝 露,崔健嬌,劉光偉

(1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450003;2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450003)

乙型病毒性肝炎(乙肝)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)均為常見的肝病,而乙型肝炎病毒(HBV)能通過參與肝組織脂質(zhì)代謝的調(diào)控,使肝細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)沉積,促使HBV感染患者發(fā)生肝脂肪變[1-3],使得乙肝合并NAFLD的人數(shù)明顯增多[4]。當(dāng)乙肝患者合并NAFLD時(shí),核苷(酸)類似物對(duì)HBV的抗病毒療效在一定程度上會(huì)受到影響[5-6];同時(shí),與未合并NAFLD的乙肝患者相比,該群體的肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,預(yù)后更差[7-9]。然而目前缺少針對(duì)乙肝合并NAFLD安全有效的治療手段,主要的治療策略為口服核苷(酸)類似物并配合運(yùn)動(dòng)及飲食習(xí)慣干預(yù)。健脾活血解毒方為河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科劉光偉教授自擬方,常聯(lián)合恩替卡韋等核苷(酸)類似物用于乙肝合并NAFLD患者的治療,然而其作用機(jī)制并不清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察了健脾活血解毒方聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙肝合并NAFLD小鼠肝細(xì)胞內(nèi)微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MTTP)-載脂蛋白B(ApoB)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響,旨在為健脾活血解毒方在臨床運(yùn)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體攜帶HBV全基因組DNA感染的C57BL/6雌性小鼠15只,4周齡,體重(15.5±1.1)g,購(gòu)自北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):110011211103614662。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF等級(jí),室溫(25±5)℃,濕度(50±10)%,24 h通風(fēng),12 h光照循環(huán),可自由飲水進(jìn)食,進(jìn)駐動(dòng)物房經(jīng)7 d隔離檢驗(yàn)期后用于實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審核通過(ZZU-LAC2021033005),實(shí)驗(yàn)操作符合中華人民共和國(guó)國(guó)家科委《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及制備 健脾活血解毒方由黃芪、白術(shù)、澤瀉、荷葉、薏苡仁、苦參、赤芍、柴胡組成,各藥材用量比例為5∶5∶5∶5∶3∶3∶5∶3,由江陰天江藥業(yè)有限公司提供的顆粒劑按相應(yīng)比例制備為湯劑。恩替卡韋分散片(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,規(guī)格:1 mg/片),研磨后溶解至生理鹽水中制備為混懸液。按照動(dòng)物與人體間的等效劑量關(guān)系[10]換算給藥劑量。

1.3主要試劑 4%多聚甲醛(BK539A,Biosharp);磷酸酶抑制劑(S1873,碧云天);PMSF(P105539,阿拉丁);RIPA裂解液(P0013B,碧云天);小鼠單抗β-actin(BM0627,武漢博士德生物工程有限公司);兔多抗MTTP(A1746,ABclonal);兔多抗ApoB(DF12533,Affinity);HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(BA1054,武漢博士德生物工程有限公司);Trizol(15596-026,Ambion);SYBR Green Master Mix(Q111-02,VAZYME);Taq Plus DNA Polymerase(ET105-01,TIANGEN);DL2000 DNA Marker(MD114-02,TIANGEN);dNTP(CD117,TIANGEN);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)檢測(cè)試劑盒(C009-2-1,南京建成);谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)檢測(cè)試劑盒(C010-2-1,南京建成);Mouse ApoB ELISA Kit(E-EL-M3017,Elabscuence);Mouse 極低密度脂蛋白(VLDL),ELISA Kit(EM1863,Fine Test),QIAamp Viral RNA Mini Handbook試劑盒(QIAGEN)。

1.4主要儀器 微量移液器(Eppendorf);電泳儀(DYY-7C,北京六一儀器廠);垂直電泳槽(DYCZ-24DN,北京六一儀器廠);電轉(zhuǎn)儀(DYCZ-40,北京六一儀器廠);水平搖床(TS-1,江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);電子天平(CPA,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);酶標(biāo)儀(Thermo);離心機(jī)(HI650,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司);FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices);PCR儀(EDC-810,東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272,上海精宏);分光光度計(jì)(752,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 對(duì)rAAV載體轉(zhuǎn)染的小鼠進(jìn)行60%脂肪供能高脂飼料(XTHF60,協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司)喂養(yǎng)12周建立乙肝合并NAFLD后[11],采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為模型組、恩替卡韋組和聯(lián)合中藥組,每組5只。恩替卡韋組給予恩替卡韋0.1 mg/kg灌胃,每日1次;聯(lián)合中藥組給予恩替卡韋0.1 mg/kg灌胃(每日1次)及健脾活血解毒方湯劑50 mg/kg灌胃(每周一、三、五各1次);模型組灌胃同等量生理鹽水,均連續(xù)灌胃12周。

1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1血清GOT、GPT、ApoB、VLDL水平及HBV DNA載量 小鼠麻醉后處死前眼眶取血,離心后經(jīng)移液槍取血清轉(zhuǎn)至滅菌后的1.5 mL EP管中,-80 ℃保存。血清樣品預(yù)處理后,按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6.2肝臟脂肪變和纖維化情況 采用HE染色及天狼星紅染色進(jìn)行觀察。HE染色:取4%多聚甲醛固定的肝組織,經(jīng)酒精從低濃度到高濃度梯度脫水,二甲苯透明,浸蠟后包埋切片;切片先經(jīng)二甲苯脫蠟,再經(jīng)酒精從高濃度到低濃度梯度水化,然后蘇木精-伊紅染色,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像(每張切片選取4個(gè)不同的視野)。天狼星紅染色:切片步驟同上,對(duì)切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化,使用天狼星紅染色液滴染10 min,流水沖洗,去除切片表面染液,梯度脫水后二甲苯透明,中性樹膠封固,光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6.3肝組織中MTTP、ApoB蛋白表達(dá)情況 采用Western blot法檢測(cè):取-80 ℃保存的肝組織,使用單去污劑裂解液裂(含PMSF)提取肝組織總蛋白,酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白樣品OD值,計(jì)算樣品蛋白濃度。將蛋白變性,電泳分離后電轉(zhuǎn)膜。用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜,室溫?fù)u床封閉2 h。用封閉液稀釋相應(yīng)的一抗(β-actin 1∶200,ApoB1∶1 000,MTTP 1∶1 000),4 ℃孵育過夜,洗滌。用TBST稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗(1∶50 000),孵育2 h,洗滌。顯色曝光后掃描膠片,用BandScan分析膠片灰度值。

1.6.4肝組織中MTTP、ApoB mRNA表達(dá)情況 取-80 ℃保存的肝組織,Trizol法提取總RNA,采用兩步法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Primer5軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物序列:β-actin的上游引物序列為5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’,下游引物序列為5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’;MTTP的上游引物序列為5’-CACTCAGGCAATTCGAGACA-3’,下游引物序列為5’-TATCGCTTTCTGGCTGAGGT-3’;ApoB的上游引物序列為5’-GCCATGTCCAGGTACGAACT-3’,下游引物序列為5’-TGGTACGGTTCCCTTTCTTG。使用EDC-810 PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),擴(kuò)增反應(yīng)條件:預(yù)變性,95 ℃ 10 min,1個(gè)循環(huán);變性,95 ℃ 15 s,退火延伸;60 ℃ 60 s,40個(gè)循環(huán);熔解曲線采集,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃15 s,1個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清HBV DNA載量及GOT、GPT、ApoB、VLDL水平 恩替卡韋組和聯(lián)合中藥組血清HBV DNA載量及GOT、GPT水平均明顯低于模型組(P均<0.05),且聯(lián)合中藥組血清HBV DNA載量及GOT、GPT水平均明顯低于恩替卡韋組(P均<0.05);恩替卡韋組和聯(lián)合中藥組血清ApoB、VLDL水平均明顯高于模型組(P均<0.05),且聯(lián)合中藥組血清ApoB、VLDL水平均明顯高于恩替卡韋組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組小鼠血清HBV DNA載量及肝酶、ApoB、VLDL水平

2.2各組小鼠肝脂肪變及肝纖維化程度 所有小鼠肝臟被膜完整,整體呈粉紅色,形態(tài)飽滿,均未見明顯縮小,可見紅白相間紋理。HE染色及天狼星紅染色顯示:模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,小葉內(nèi)肝細(xì)胞廣泛水腫,大量肝細(xì)胞氣球樣變及脂肪變性;匯管區(qū)周圍纖維化,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶;大量膠原纖維形成條索狀纖維隔,重新分隔肝小葉,形成橋接壞死。恩替卡韋組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)尚完整,小葉內(nèi)肝細(xì)胞輕度水腫,肝細(xì)胞氣球樣變及脂肪變性較模型組小鼠稍有減輕;匯管區(qū)周圍仍有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)灶;可見點(diǎn)狀壞死。聯(lián)合中藥組小鼠肝細(xì)胞氣球樣變及脂肪變性較恩替卡韋組明顯減輕,匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)范圍及點(diǎn)狀壞死均更少。見圖2。

圖2 各組小鼠肝臟組織HE染色及天狼星紅染色形態(tài)

2.3各組小鼠肝臟組織中MTTP、ApoB蛋白及mRNA表達(dá)情況 恩替卡韋組ApoB蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),恩替卡韋組MTTP蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量與聯(lián)合中藥組MTTP、ApoB蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05),且聯(lián)合中藥組MTTP、ApoB蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于恩替卡韋組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組小鼠肝臟組織中MTTP、ApoB蛋白及mRNA表達(dá)情況

3 討 論

現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者根據(jù)乙肝和NAFLD的臨床表現(xiàn),將其歸入傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中的“脅痛”“黃疸”“鼓脹”“癥積”等病證范疇。在中醫(yī)理論中,肝臟具有獨(dú)特的生理功能,當(dāng)各種病因損及肝臟時(shí),導(dǎo)致氣機(jī)失于暢達(dá),疏泄職能失司,血液貯藏調(diào)節(jié)失調(diào),故而痰濁、瘀血乃生,久則化為濁毒內(nèi)蘊(yùn);肝膽之病最易損傷脾胃,病久及腎,肝、脾、胃、腎功能失司,水液輸布代謝異常,痰濕乃生,日久化瘀生熱,痰、濕、瘀、熱等病理產(chǎn)物結(jié)于體內(nèi),繼而傷肝。有醫(yī)家認(rèn)為慢性乙肝患者機(jī)體以肝膽脈絡(luò)受損為主;病邪侵襲肝臟時(shí),肝的藏血、疏泄功能失用,致肝體肝用皆損,易循經(jīng)入絡(luò)入血分,氣血運(yùn)行停滯不暢,病理產(chǎn)物及脂肪堆積,易合并脂肪肝[12]。《難經(jīng)》中記載“見肝之病,則知肝當(dāng)傳之于脾,故先實(shí)其脾氣,無令得受肝之邪,故曰治未病焉”,《金匱要略》記載“見肝之病,知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”,均闡釋了脾胃與肝病關(guān)系密切,調(diào)補(bǔ)脾胃有助于肝病的治療和轉(zhuǎn)歸。如李知玉等[13]研究報(bào)道,干擾素聯(lián)合健脾化痰祛瘀治療乙肝合并NAFLD患者可明顯降低血脂、BMI及腰臀比,減輕肝脂肪變程度,且抗病毒療效顯著提高。韓祎迪等[14]發(fā)現(xiàn)殼脂膠囊聯(lián)合恩替卡韋治療乙肝合并NAFLD患者可調(diào)節(jié)血脂水平及減輕肝臟炎癥,升高肝脾CT比值。既往研究證實(shí)聯(lián)合中藥治療對(duì)HBV DNA載量及肝脂肪變的改善效果均優(yōu)于單純西藥治療,但對(duì)其作用機(jī)制研究較少。

既往研究發(fā)現(xiàn),ApoB在HBV轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中表達(dá)量較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞低, HBV對(duì)MTTP-ApoB脂質(zhì)代謝途徑具有抑制作用[15-17]。ApoB在肝細(xì)胞或小腸細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與脂類物質(zhì)結(jié)合,形成含ApoB脂蛋白(B-LPs)的球狀微粒,進(jìn)一步將膳食脂肪和內(nèi)源性脂肪通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)至不同的組織,避免脂肪過度蓄積產(chǎn)生脂毒性[18-19]。MTTP是ApoB參與B-LPs組裝和分泌的調(diào)節(jié)因子[20]。首先,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的MTTP將胞內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至ApoB,使ApoB完成初步的脂質(zhì)化,形成原始B-LPs;然后MTTP與ApoB的N-末端間離子相互作用,進(jìn)一步增加脂蛋白的總長(zhǎng)度,原始B-LPs與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的脂滴進(jìn)一步融合,轉(zhuǎn)化為更大的粒子[21-22];最后B-LPs通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體,進(jìn)一步成熟后分泌至細(xì)胞外。當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)有HBV時(shí),HBV抑制MTTP和ApoB在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),B-LPs的合成減少,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積,促使肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變,從而影響抗病毒治療獲益。現(xiàn)有研究表明,MTTP有望作為治療脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病潛在藥物靶點(diǎn)[23-25]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示,健脾活血解毒方與恩替卡韋聯(lián)用能夠通過上調(diào)MTTP表達(dá),進(jìn)一步影響ApoB的豐度,削弱HBV對(duì)MTTP-ApoB脂質(zhì)代謝途徑的抑制作用,促進(jìn)肝臟內(nèi)源性脂質(zhì)向外周轉(zhuǎn)運(yùn),減輕肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。本研究為乙肝合并NAFLD患者的臨床治療及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了一定參考,但受限于動(dòng)物疾病模型并不能反映人體疾病發(fā)展的實(shí)際情況,健脾活血解毒方聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙肝合并NAFLD患者的療效及安全性仍有待隨機(jī)對(duì)照大樣本的臨床研究進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。