斂瘡生肌灌腸療法對潰瘍性結腸炎大鼠IL-6、IL-10、NF-κBp65、ICAM-1表達的影響

劉竺華,李立娟,任順平,李寶樂,郝海蓉,李佩芳,張小強,陳 翩

(1. 山西中醫藥大學附屬醫院,山西 太原 030024;2. 中鐵十七局有限公司中心醫院,山西 太原 030024;3. 山西省針灸醫院,山西 太原 030024;4. 武漢賽維爾生物科技有限公司,湖北 武漢 430000)

潰瘍性結腸炎是一種慢性炎癥性疾病,通常始于青年時期,并持續終身,除了影響工作和生活外,還可誘發結直腸癌[1]。目前西醫主要采用5氨基水楊酸、糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑等治療,效果不太理想[2]。中醫認為活動期潰瘍性結腸炎屬于“瘡瘍”疾病范疇,其治療亦可參照瘡瘍的治則。大量研究證實中藥保留灌腸是治療潰瘍性結腸炎的有效方法[3]。本課題組前期研究表明斂瘡生肌灌腸療法可以顯著降低潰瘍性結腸炎大鼠血清及結腸組織中 白細胞介素-1β(IL-1β)的含量,從而修復受損的結腸組織[4],但其作用機制尚未完全明確。本實驗旨在通過觀察潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜組織中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、核轉錄因子κBp65(NF-κBp65)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達情況,探討斂瘡生肌灌腸療法調節腸黏膜免疫炎癥反應的機制,為本法治療潰瘍性結腸炎提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠30只,雌雄各半,體重(200±30)g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2020-0101。大鼠飼養于SPF級動物實驗室,溫度22～24 ℃,濕度50%～60%,12 h明暗循環,飼料和飲用水消毒后由動物自由攝取。

1.2試劑與儀器 2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)原液(5%水溶液,Sigma,貨號:P2297-10ML),50%乙醇溶液(國藥集團化學試劑有限公司,貨號:10009218),10%水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司),4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司),石蠟油(國藥集團化學試劑有限公司),IL-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒,NF-κBp65免疫組化試劑盒,RT-PCR半定量分析試劑盒(Bio-rad)。

1.3實驗藥物 自擬斂瘡生肌方(由青黛5 g、枯礬10 g、赤石脂10 g、爐甘石10 g、血竭10 g組成),藥材由山西中醫藥大學附屬醫院提供。按組方稱取藥材,加10倍水煎煮1 h,過濾藥液后,加5倍水繼續煎煮1 h,過濾,合并濾液,濃縮成藥量為0.45 g /mL的濃縮液。大鼠每日灌腸劑量參照實驗動物與人的體表面積比值表[5]來計算,實驗大鼠用量大約為2 mL,溶液置于4 ℃的冰箱保存備用,灌腸前需溫熱。

1.4實驗方法 大鼠適應性飼養1周后,隨機取10只大鼠作為正常組;剩余20只大鼠參照文獻[5-6]中方法建立潰瘍性結腸炎模型,造模成功后將大鼠隨機分為模型組、斂瘡生肌組,每組10只。造模方法:大鼠禁食(不禁水)24 h后,采用10%水合氯醛麻醉大鼠,將石蠟油充分潤滑的硅膠管緩緩插入大鼠腸腔內,一次性從硅膠管內注入按1∶1比例混合的TNBS和 50% 乙醇溶液0.25 mL,提起大鼠尾部,另一只手捏緊其肛門,將其持續倒置約5 min。造模結束后,使動物平躺,自然清醒,自由飲食。觀察3 d,以大鼠出現疲倦、懶動、少食、從糊狀便到液態血便、體重減輕等表現表示造模成功。從第4天開始,斂瘡生肌組給予0.45 g/mL的斂瘡生肌方濃縮水煎液2 mL灌腸,模型組、正常組給予等量生理鹽水灌腸,灌腸前按摩大鼠腹部及肛門,使其排空糞便,每日定時灌腸1次,連續灌腸7 d。

1.5取材方法 末次灌腸結束后第2天,促使大鼠排便后稱重,腹腔注射10%水合氯醛后沿大鼠腹部矢狀線打開腹腔,截取肛門之上2 cm到盲腸的整段結腸,沿腸系膜縱向切開,清理糞便,生理鹽水反復沖洗后平鋪于冰塊上,觀察腸黏膜充血、水腫、糜爛程度及潰瘍大小等。取病變最明顯的部分組織5塊,2塊分裝入2個EP管中,對其進行標記存于-80 ℃冰箱,以備RT-PCR半定量分析;2塊用4%多聚甲醛固定以備免疫組化及ELISA法檢測;1塊置于4%甲醛中固定,石蠟包埋后切片,用于HE染色觀察。

1.6觀察指標

1.6.1一般情況及DAI評分 觀察各組大鼠的精神狀態、大小便、飲食、皮毛、體重等情況,計算DAI評分。DAI評分=(體重下降分數+大便性狀分數+便血分數)/ 3。體重無下降為0分,下降<5%為1分,下降5%～10%為2分,下降>10%～15%為3分,下降>15%為4分;大便性狀正常為0分,松散為2分,稀便為4分;便隱血:正常為0分,隱血陽性為2分,顯性出血為4分。

1.6.2結腸組織病理評分及病理形態 肉眼和鏡下觀察結腸黏膜充血、水腫、糜爛情況并進行評分,計算總分為病理評分。肉眼觀察評分標準:無損傷,黏膜光滑為0分;黏膜充血、水腫,但未出現潰瘍為1分;黏膜充血、水腫,輕度糜爛,無潰瘍為2分;黏膜充血、水腫,中度糜爛,有單個潰瘍,直徑<1 cm為3分;黏膜充血、水腫,高度糜爛,多處潰瘍,直徑<1 cm為4分;黏膜充血、水腫,重度糜爛,潰瘍直徑>1 cm為5分。鏡下觀察評分標準:黏膜固有層無中性白細胞浸潤為0分;黏膜固有層有少量中性白細胞(<10個/HPF)浸潤,累及少量隱窩為1分:黏膜固有層有明顯中性白細胞(10～50個/HPF)浸潤,累及 50%以上隱窩為2分;黏膜固有層有大量中性粒細胞(>50個/HPF)浸潤,伴隱窩膿腫為3分:固有層明顯急性炎癥伴潰瘍形成為4分。

1.6.3結腸組織中IL-6、IL-10含量 取0.5 mg結腸組織,剪碎后進行超聲勻漿, 離心后取上清液,采用ELISA法嚴格按試劑盒說明檢測IL-6、IL-10含量。

1.6.4結腸組織中NF-κBp65蛋白表達情況 采用免疫組化法檢測:取制備的結腸組織切片,脫蠟,滅活,血清封閉,加入一抗,PBS沖洗,加入二抗,PBS沖洗,加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素,37 ℃孵育30 min,PBS沖洗,顯色,復染,封片。NF-κBp65蛋白主要表達于大鼠結腸組織中的腸道黏膜及黏膜下層,細胞質中有棕黃色顆粒為陽性細胞表達。顏色越深表達越強,未出現黃綠顆粒則為陰性。采用全自動圖像分析儀與圖像分析系統測定所采集圖像的平均光密度。

1.6.5結腸組織中ICAM-1 mRNA表達情況 采用RT-PCR法檢測:取結腸上皮組織100 mg,加1 mL Trizol制成組織勻漿,提取總RNA。取總RNA 2 μL按照反轉錄試劑盒說明書方法合成cDNA,合成后測cDNA濃度,備用。GADPH上游引物序列為5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’,下游引物序列為5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’,片段長度138 bp;NF-κB p65上游引物序列為5’-TGTCAAACGGGAGATGAATGG-3’,下游引物序列為5’-CTGGCGGTAATAGGTGTAAATGG-3’,片段長度187 bp。反應條件:94 ℃變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸24 s,共32個循環,72 ℃終末延伸5 min。相對定量法計算ICAM-1 mRNA的2-ΔΔCt值。

2 結 果

2.1大鼠一般情況及DAI評分 造模后大鼠開始出現不喜動,進食少,精神差,拱背扎堆,糞便性狀改變等表現,實驗過程中模型組死亡1只;斂瘡生肌組大鼠灌胃后精神、食欲、排便情況較前逐漸好轉,體重增加,無死亡大鼠。正常組大鼠DAI評分為0分,模型組為(3.11±0.50)分,斂瘡生肌組為(2.63±0.46)分:模型組DAI評分明顯高于正常組和斂瘡生肌組(P均<0.05)。

2.2大鼠結腸組織病理評分 正常組、模型組、斂瘡生肌組結腸組織病理評分分別為(0.50±0.34)分、(2.67±0.87)分、(1.50±1.08)分,模型組結腸組織病理評分明顯高于正常組和斂瘡生肌組(P均<0.05)。

2.3大鼠結腸組織病理形態 HE染色顯示,正常組結腸組織各層結構清晰,黏膜上皮完整,腸腺數量豐富,細胞形態正常;模型組黏膜及黏膜下層有較多的炎性細胞浸潤,伴有多處淺表及深潰瘍形成,壞死灶邊緣少量腸腺擴張,形狀不規則;斂瘡生肌組可見少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 正常組和潰瘍性結腸炎各組大鼠結腸組織HE染色病理表現(×100)

2.4大鼠結腸組織中IL-6、IL-10含量 模型組結腸組織中IL-6含量明顯高于正常組和斂瘡生肌組(P均<0.05),IL-10含量明顯低于正常組和斂瘡生肌組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和潰瘍性結腸炎各組大鼠結腸組織中IL-6、IL-10含量比較

2.5大鼠結腸組織中NF-κBp65蛋白陽性表達情況 正常組可見少量NF-κBp65蛋白陽性表達,光密度值為0.189±0.021;模型組NF-κBp65蛋白陽性表達較多, 光密度值為0.415±0.032,明顯高于正常組(P<0.05);斂瘡生肌組NF-κBp65蛋白陽性表達較模型組少,光密度值為0.313±0.029,明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和潰瘍性結腸炎各組大鼠結腸組織中NF-κBp65陽性表達情況(免疫組化,×100)

2.6大鼠結腸組織中ICAM-1 mRNA表達情況 正常組、模型組、斂瘡生肌組結腸組織中ICAM-1 mRNA相對表達量分別為1.06±0.03,2.35±0.32,1.85±0.31,模型組明顯高于正常組和斂瘡生肌組(P均<0.05)。

3 討 論

潰瘍性結腸炎發病機制尚未完全明確,與遺傳、腸黏膜屏障、腸道微生態、免疫應答等均有關,其中促炎細胞因子如IL-6上調、抗炎細胞因子如IL-10下調在潰瘍性結腸炎黏膜損傷中發揮著重要作用[7]。NF-κB在潰瘍性結腸炎的發病和進展中發揮著關鍵作用,其可誘導炎癥介質的表達,其過度激活可導致大量促炎因子釋放,釋放的細胞因子又進一步活化NF-κB,使炎癥不斷放大[8]。ICAM-1是一種免疫調節因子,一般情況下腸黏膜中ICAM-1表達較低,當腸黏膜出現病變后,ICAM-1與炎性細胞因子互相作用可使炎癥加重,形成惡性循環[9]。

潰瘍性結腸炎歸屬于中醫“久痢”“久瀉”等范疇,病位在大腸,與脾、肝、腎、肺有密不可分的關系。濕熱蘊結腸道,氣血瘀阻為基本病機,脾虛為發病之本,飲食不調多為誘因。本病活動期以標實為主,緩解期多屬本虛標實,主要為脾虛失健,正虛邪戀,也有兼腎虧者。《景岳全書》記載“脾腎虛弱之輩,但犯生冷極易作痢”“泄瀉之本,多責之于脾腎”。活動期潰瘍性結腸炎可以被理解為瘡瘍在腸道的一種表現,《醫略》記載“以痢之赤白膿血,是癰瘍之類”,《醫學心悟》載“治痢之法必參合治癰之意”,故可稱潰瘍性結腸炎為“內癰”“內瘍”。本研究中藥灌腸方以斂瘡生肌為治療原則,方中青黛性寒,具有清熱解毒、涼血消斑之功,《得配本草》記載“青黛,除郁火,解熱毒,……止血痢”; 枯礬取其澀腸止瀉之功,《神農本草經》稱其具有“主寒熱泄痢”之功,《本草綱目》記載“治諸血痛……瘡瘍,取其酸澀而收之性也”;赤石脂具有澀腸止瀉、收斂止血、斂瘡生肌之功;爐甘石有生肌斂瘡、收濕止癢、解毒明目之功;血竭具有活血定痛、化瘀止血、斂瘡生肌之功,《本草分經》記載其“甘咸平性急,入心肝血分,散瘀生新,和血斂瘡”;全方藥量精當,共奏斂瘡生肌之功。現代藥理研究顯示,青黛可以降低IL-6、IL-10、IL-1等促炎因子的水平,具有調節腸道免疫反應及改善腸道菌群的功能[10];赤石脂具有抑制血小板聚集,吸附腸道有害物質,清潔腸道作用[11-12];煅爐甘石具有促進大鼠傷口成纖維細胞及毛細血管形成的作用,可加快肉芽組織增生,從而加快傷口愈合[13-14];血竭具有抗炎、鎮痛、促進創面愈合和改善腸黏膜微循環等作用[15-16]。

本實驗結果顯示,斂瘡生肌組DAI評分、結腸組織病理學評分及結腸組織中IL-6含量、NF-κBp65蛋白表達光密度值、ICAM-1 mRNA表達量均明顯低于模型組,結腸組織中IL-10含量明顯高于模型組。提示斂瘡生肌灌腸療法可能通過上調IL-10表達和下調IL-6、NF-κBp65、ICAM-1表達,從而減輕潰瘍性結腸炎大鼠腸道免疫炎癥反應,促進腸黏膜修復。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。