山楂酸通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡保護(hù)急性肺損傷的研究

柯維強(qiáng),陳小玲,蔡楊靖

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,海南 ?？?570216)

急性肺損傷是由多種致病因素引起的急性彌漫性炎癥性肺損傷,是一種機(jī)體過度炎癥反應(yīng)綜合征,其主要特征為嚴(yán)重低氧血癥、肺水腫、肺中重度中性粒細(xì)胞積聚等,具有較高的病死率[1]。脂多糖(LPS)感染是導(dǎo)致急性肺損傷的常見原因,LPS可結(jié)合細(xì)胞表面受體,調(diào)控包括炎癥信號(hào)通路在內(nèi)的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,激活氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),刺激肺部發(fā)生彌漫性損傷[2-3]。急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,促炎/抗炎反應(yīng)失衡、氧化/抗氧化失衡等均與該病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),目前仍沒有有效的藥物治療方法[4],其發(fā)病機(jī)制和治療策略一直是研究的焦點(diǎn)。山楂酸是一種五環(huán)三萜類天然活性物質(zhì),主要從橄欖中分離得到,其具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌、神經(jīng)保護(hù)、肝保護(hù)等生物學(xué)特性[5]。Lee等[6]研究發(fā)現(xiàn),在LPS處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和小鼠肺組織損傷中,山楂酸通過調(diào)控相關(guān)炎性細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮重要的抗炎作用。Hsia等[7]研究報(bào)道,山楂酸可通過介導(dǎo)線粒體凋亡和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α通路對(duì)肺癌A549細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用,具有抗肺癌活性。Jeong等[8]研究發(fā)現(xiàn),山楂酸可通過Toll樣受體4(TLR4)-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)-自噬途徑抑制炎癥細(xì)胞浸潤,減輕顆粒物誘導(dǎo)的肺損傷。上述研究提示山楂酸可能是一種治療炎癥性疾病的理想藥物。本實(shí)驗(yàn)基于介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll樣受體4(TLR4)信號(hào)通路,探討了山楂酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的肺保護(hù)作用,以為臨床研發(fā)治療急性肺損傷的藥物提供客觀依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠78只,6～8周齡,體重180～220 g,購自海南藥物研究所有限責(zé)任公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(瓊)2020-0007。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度18～24 ℃,相對(duì)濕度50%～70%,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(K20220318076)。

1.2藥物、試劑及儀器 山楂酸購自成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司(純度≥98.0 %,規(guī)格:20 mg);地塞米松磷酸鈉注射液購自國藥集團(tuán)容生制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H41020036,規(guī)格:1 mL∶5 mg);LPS購自北京索萊寶科技有限公司(純度≥98.0 %,規(guī)格:100 mg);HE染色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液、ECL購自武漢博爾夫生物科技有限公司;IL-6、IL-8、TNF-α ELISA試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)公司;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;GAPDH、HMGB1、TLR4抗體,辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購自武漢菲恩生物科技有限公司。R407小動(dòng)物呼吸機(jī)購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司;光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司;JP-2880全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠飼養(yǎng)1周并稱重后,隨機(jī)選取15只作為正常組,給予腹腔注射5 mg/kg生理鹽水,其余大鼠腹腔注射5 mg/kg LPS制備急性肺損傷模型。造模后觀察大鼠出現(xiàn)呼吸短促、精神萎靡,病理組織形態(tài)學(xué)觀察到大鼠肺泡有充血及出血,肺泡腔中聚集大量中性粒細(xì)胞,并且肺組織濕/干重比值明顯升高即表示造模成功。將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為肺損傷組、山楂酸低劑量組、山楂酸高劑量組、地塞米松組,每組15只。造模成功后第2天,山楂酸低劑量組大鼠腹腔注射25 mg/kg山楂酸溶液,山楂酸高劑量組大鼠腹腔注射100 mg/kg山楂酸溶液,地塞米松組大鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松注射液,正常組和肺損傷組大鼠均腹腔注射等量生理鹽水,均1次/d,連續(xù)注射8周。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1肺組織濕/干重比值 各組大鼠末次注射后禁食12 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后,取右肺,用超純水清洗,濾紙吸干肺表面水分,稱取肺重量,標(biāo)記為濕重,然后將肺置于60 ℃恒溫干燥箱中干燥48 h,再次稱取肺重量,標(biāo)記為干重,計(jì)算肺組織濕/干重比值。

1.4.2肺組織病理形態(tài) 取各組大鼠左肺,用4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋,制成6 μm的切片,根據(jù)HE染色試劑盒進(jìn)行HE染色,封片后置于光學(xué)顯微鏡下拍照、觀察。

1.4.3支氣管肺泡灌洗液中炎性因子含量 大鼠麻醉取肺組織前,用預(yù)冷的生理鹽水注入氣管行肺泡灌洗,重復(fù)3次收集支氣管肺泡灌洗液,于4℃、3 000 r/min離心20 min收集上清液,根據(jù)ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8、TNF-α含量。

1.4.4肺組織細(xì)胞凋亡情況 將大鼠肺組織石蠟切片脫蠟至水,加入3% H2O2溶液浸洗10 min,隨后用蛋白酶K工作液修復(fù),按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作染色,封片后置于熒光顯微鏡下采集圖像,計(jì)算細(xì)胞凋亡率,其中陽性細(xì)胞呈綠色熒光,正常細(xì)胞呈藍(lán)色熒光。

1.4.5肺組織中HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)情況采用Western blot法檢測:使用RIPA緩沖液提取大鼠肺組織的總蛋白,用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將提取的蛋白于95 ℃煮沸5 min,取等量的蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。隨后用5%脫脂牛奶封膜2 h,用稀釋的HMGB1(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、GAPDH (1∶5 000)一抗在4 ℃孵育過夜,經(jīng)過TBST洗膜,HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵化1.5 h,利用ECL發(fā)光液顯影,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Image J圖像軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織濕/干重比值 肺損傷組大鼠肺組織濕/干重比值明顯高于正常組(P<0.05);山楂酸低、高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織濕/干重比值均明顯低于肺損傷組(P均<0.05),且山楂酸高劑量組和地塞米松組均明顯低于山楂酸低劑量組(P均<0.05),山楂酸高劑量組和地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2各組大鼠肺組織病理形態(tài) 正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔均勻,肺泡腔清晰,未見炎性細(xì)胞浸潤;肺損傷組大鼠肺組織明顯水腫、充血,肺泡間隔變寬,肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤;山楂酸低、高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織病變均較肺損傷組輕,肺泡間隔呈輕度增寬,肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤,且山楂酸高劑量組和地塞米松組大鼠肺組織病變較山楂酸低劑量組輕。見圖2。

2.3各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性因子含量肺損傷組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α含量均明顯高于正常組(P均<0.05);山楂酸低、高劑量組和地塞米松組IL-6、IL-8、TNF-α含量均明顯低于肺損傷組(P均<0.05),且山楂酸高劑量組和地塞米松組各指標(biāo)含量均明顯低于山楂酸低劑量組(P均<0.05),山楂酸高劑量組和地塞米松組各指標(biāo)含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和急性肺損傷各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中炎性因子含量比較

2.4各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率 肺損傷組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率為(36.51±2.60)%,明顯高于對(duì)照組的(4.43±0.85)%(P<0.05);山楂酸低、高劑量組和地塞米松組大鼠細(xì)胞凋亡率分別為(28.33±2.18)%、(17.69±1.74)%、(16.92±1.61)%,均明顯低于肺損傷組(P均<0.05),且山楂酸高劑量組和地塞米松組均明顯低于山楂酸低劑量組(P均<0.05),山楂酸高劑量組和地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組細(xì)胞凋亡TUNEL染色見圖3。

圖3正常組和急性肺損傷各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

2.5各組大鼠肺組織中HMGB1-TLR4軸相關(guān)蛋白表達(dá)情況 肺損傷組大鼠肺組織中HMGB1和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05);山楂酸低、高劑量組和地塞米松組HMGB1和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于肺損傷組(P均<0.05),且山楂酸高劑量組和地塞米松組HMGB1和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于山楂酸低劑量組(P均<0.05),山楂酸高劑量組和地塞米松組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 正常組和急性肺損傷各組大鼠肺組織中HMGB1-TLR4軸相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

山楂酸存在于中草藥、蔬菜、水果等多種天然來源的物質(zhì)中,對(duì)人體有著很高的安全性,因其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[9]。Li等[10]報(bào)道,山楂酸通過降低活性氧水平和抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而改善高糖誘導(dǎo)的人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮功能障礙。Yap等[11]報(bào)道,山楂酸可以抑制分泌型磷脂酶A2-ⅡA(sPLA2-ⅡA)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥作用。Ampofo等[12]發(fā)現(xiàn),山楂酸可通過抑制核因子-κB(NF-κB)介導(dǎo)的黏附分子表達(dá),減輕缺血/再灌注誘導(dǎo)的組織損傷和炎癥反應(yīng)。Chen等[13]研究顯示,山楂酸可通過調(diào)控PI3K/Akt/NF-κB途徑抑制IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,山楂酸能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織濕/干重比值,減輕肺組織病理損傷和炎性細(xì)胞浸潤,且高劑量山楂酸作用效果與地塞米松的效果相當(dāng)。提示山楂酸對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用,其作用效果與劑量有關(guān)。

IL-6、IL-8、TNF-α是促炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn),IL-6過表達(dá)的肺疾病患者住院時(shí)間明顯延長,繼發(fā)感染的發(fā)生率升高,IL-6可作為監(jiān)測急性肺損傷的生物標(biāo)志物之一[14]。TNF-α表達(dá)水平與急性肺損傷患者生存結(jié)局呈負(fù)相關(guān),TNF-α表達(dá)增加可使肺上皮通透性增加,誘導(dǎo)肺組織損傷和中性粒細(xì)胞積聚,導(dǎo)致肺水腫[15-16]。IL-8是一種中性粒細(xì)胞激活劑,可與自身抗體結(jié)合形成復(fù)合物,以復(fù)合物的形式激活中性粒細(xì)胞的趨化作用,延緩中性粒細(xì)胞凋亡,從而加重炎癥反應(yīng),其可通過抑制肺表面活性劑蛋白A和表面活性劑蛋白B表達(dá)水平促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞活性,最終導(dǎo)致急性肺損傷[17]。多項(xiàng)研究報(bào)道,山楂酸可通過降低IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平減輕炎性反應(yīng)[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各藥物組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α含量均明顯降低,且山楂酸高劑量組與地塞米松組IL-6、IL-8、TNF-α含量差異不明顯,提示山楂酸可抑制肺組織炎癥反應(yīng),且高劑量作用效果與地塞米松相當(dāng)。

在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展過程中,細(xì)胞凋亡與急性肺損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[21-22]。肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞等的異常凋亡均可能導(dǎo)致急性肺損傷中上皮屏障功能受損和某些間充質(zhì)細(xì)胞重構(gòu)[23-24]。此外,不受控制的凋亡途徑的激活會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肺組織損傷,這表明抑制凋亡可能是一種有效的急性肺損傷治療策略[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,山楂酸干預(yù)可顯著降低急性肺損傷大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率,提示山楂酸可通過抑制細(xì)胞凋亡在急性肺損傷中發(fā)揮作用。

HMGB1是一種核蛋白,也是炎癥細(xì)胞因子,其在炎癥反應(yīng)后期被巨噬細(xì)胞釋放。HMGB1是TLR4的潛在上游調(diào)控因子,HMGB1通過TLR4依賴通路誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子釋放和產(chǎn)生趨化因子,HMGB1/TLR4信號(hào)通路通過不同機(jī)制參與包括急性肺損傷在內(nèi)的多種炎癥性疾病[26-27],抑制HMGB1/TLR4信號(hào)通路可能在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用[28]。Li等[29]研究報(bào)道,山楂酸可通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4信號(hào)通路減輕缺血/再灌注損傷心肌炎癥和抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,山楂酸低、高劑量組大鼠肺組織中HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)量均明顯低于肺損傷組,提示山楂酸可能通過抑制HMGB1/TLR4信號(hào)通路減輕肺損傷。

綜上所述,山楂酸可通過調(diào)節(jié)HMGB1/TLR4信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡而減輕急性肺損傷,其具體作用機(jī)制及量效關(guān)系還有待研究探討。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。