利用SSR標(biāo)記鑒定新疆地方葡萄品種資源親緣關(guān)系

王勇 孫鋒 李玉玲 蘇來(lái)曼·艾則孜 伍國(guó)紅 郭平峰

新疆是我國(guó)重要的葡萄種植區(qū)，葡萄面積和產(chǎn)量均居全國(guó)首位，同時(shí)擁有豐富的葡萄種質(zhì)資源。在葡萄生產(chǎn)中，主要通過(guò)枝蔓扦插、綠枝嫁接等無(wú)性繁殖方式繁育苗木，一些小型育苗企業(yè)或果農(nóng)根據(jù)自己的意愿隨意命名，導(dǎo)致“多品同名”或“同物異名”現(xiàn)象嚴(yán)重，給苗木市場(chǎng)經(jīng)營(yíng)和果農(nóng)生產(chǎn)造成了很大影響，甚至產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)損失。新疆葡萄瓜果研究所幾十年來(lái)不斷在全疆開(kāi)展葡萄種質(zhì)資源普查、收集與保存工作，目前已收集疆內(nèi)大多數(shù)地方品種資源，現(xiàn)選擇6組地方品種資源利用SSR標(biāo)記對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行鑒定，為品種資源利用和新疆葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?植物材料? ?試驗(yàn)材料均來(lái)自新疆葡萄瓜果研究所葡萄種質(zhì)資源圃，為4年生6個(gè)新疆地方品種近似或疑似組合19個(gè)品種，詳見(jiàn)? ? 表1。

1.2? ?引物? ?引物為課題組前期以107份葡萄種質(zhì)資源為材料篩選出的15對(duì)SSR標(biāo)記，詳見(jiàn)表2。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ?葡萄基因組DNA的提取? ?參照CTAB改良法提取葡萄試材基因組DNA；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的試材基因組DNA的濃度和純度；將DNA溶液分為兩份，1份放入? -20 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存，1份放入4 ℃冰箱中 備用。

1.3.2? ?反應(yīng)體系? ?使用PCR反應(yīng)體系為2×Taq Mix酶10 μL，SSR雙引物混合液（10 μmol/mL）0.8 μL，模板（20 ng/μL）2 μL，dd H2O 7.2 μL；總反應(yīng)體系為20 μL，PTC-100型PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增程序參照王勇等的方法，在操作中根據(jù)各引物差異進(jìn)行體系優(yōu)化。

1.3.3? ?PCR產(chǎn)物的檢測(cè)? ?利用2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行水平電泳檢測(cè)，若有擴(kuò)增結(jié)果不理想的，需要進(jìn)行補(bǔ)充，然后由生物技術(shù)公司通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)產(chǎn)物片段種類(lèi)和大小。

1.3.4? ?數(shù)據(jù)分析? ?利用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，利用NTSYSpc 2.10 s軟件繪制遺傳距離矩陣和親緣關(guān)系樹(shù)狀圖，進(jìn)行親緣關(guān)系分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?參試品種組合的親緣關(guān)系? ?如表3所示，15對(duì)SSR標(biāo)記在6組新疆地方品種組中擴(kuò)增的位點(diǎn)基因和等位基因的數(shù)量存在很大差異。擴(kuò)增基因數(shù)在26～58之間，其中馬奶子近似? 品種最多（58個(gè)），無(wú)核白近似品種最少（26個(gè)）。

6組新疆地方品種組中，每一組所有品種具有的相同基因比率在6.9%～100%之間。其中，無(wú)核白近似品種和木納格近似品種的最高，均為100%；馬奶子近似品種的最低，為6.9%；其次為和田地方品種的，為8%。

擴(kuò)增等位基因數(shù)在15～51之間，其中馬奶子近似品種最多（51個(gè)），無(wú)核白近似品種最少（15個(gè)）。6組新疆地方品種組中的每一組合所有品種具有的相同基因比率在0%～100%之間。其中，無(wú)核白近似品種和木納格近似品種的最高，均為100%；馬奶子近似品種的最低，為0。這說(shuō)明6個(gè)組每個(gè)組品種間的親緣關(guān)系存在很大差異，大小順序?yàn)轳R奶子近似品種>和田地方品種>喀什喀爾疑似品種>無(wú)核白雞 心疑似品種>木納格近似品種=無(wú)核白近似? ? 品種。

2.2? ?參試品種組合親緣關(guān)系分析

2.2.1? ?無(wú)核白5個(gè)近似品種親緣關(guān)系分析? ?無(wú)核白、長(zhǎng)穗無(wú)核白、長(zhǎng)粒無(wú)核白、大粒無(wú)核白、香蕉王的遺傳距離和相似系數(shù)如圖1所示。5個(gè)品種的遺傳距離為0，相似系數(shù)為1，說(shuō)明長(zhǎng)穗無(wú)核白、長(zhǎng)粒無(wú)核白、大粒無(wú)核白、香蕉王應(yīng)為無(wú)核白營(yíng)養(yǎng)系，在15個(gè)SSR標(biāo)記基因位點(diǎn)上不存在差異。

2.2.2? ?參試馬奶子5個(gè)近似品種親緣關(guān)系分析馬奶子、夏馬奶、紅馬奶、紫馬奶、里扎馬特的遺傳距離和相似系數(shù)如圖2所示。就遺傳距離而言，最近的是馬奶子與夏馬奶，為0.018 2，其次為紅馬奶與紫馬奶，為0.668 9；最遠(yuǎn)的是里扎馬特與紫馬奶，為1.250 9，其次為紅馬奶與夏馬奶，為1.029 6；其他品種間的值居于中間。就相似系數(shù)而言，相似度最高的是馬奶子與夏馬奶，為0.98，其次為馬奶子與里扎馬特，為0.538，相似度最低處為0.46，在此處將5個(gè)品種分為兩類(lèi)：一類(lèi)為馬奶子、夏馬奶、里扎馬特，另一類(lèi)為紅馬奶、紫馬奶。在相似系數(shù)0.538處將里扎馬特與馬奶子、夏馬奶分開(kāi)；在相似系數(shù)0.564處將紅奶子與紫馬奶分開(kāi)。這說(shuō)明，5個(gè)品種中，馬奶子與夏馬奶存在較近的親緣關(guān)系，與其他品種及其他品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為不同類(lèi)型品種，可能因果實(shí)性狀類(lèi)似馬奶而命名。

2.2.3? ?參試和田地方品種親緣關(guān)系分析? ?圖3 表明，和田地區(qū)的3個(gè)地方品種的遺傳距離較遠(yuǎn)，相似系數(shù)較小。其中和田紅與和田綠、和田黃的遺傳距離分別為0.916 3、1.252 6，和田黃與和田綠的遺傳距離為0.800 6。和田紅與和田綠、和田黃的相似系數(shù)約為0.35，和田綠與和田黃的相似系數(shù)為0.46。這說(shuō)明3個(gè)品種可能為不同類(lèi)型品種。

2.2.4? ?參試木納格近似品種親緣關(guān)系分析? ?圖4表明，綠木納格與紅木納格的遺傳距離為0，親緣關(guān)系相似系數(shù)為1。這說(shuō)明兩者可能為同一品種或其中一個(gè)為另一個(gè)的芽變類(lèi)型。

2.2.5? ?參試無(wú)核白雞心疑似品種親緣關(guān)系分析? 圖5表明，無(wú)核白雞心與香妃無(wú)核白雞心的遺傳距離為0.557 7，親緣關(guān)系相似系數(shù)為0.4。這說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不是同一品種。

2.2.6? ? 參試喀什喀爾與花葉哈什哈爾親緣關(guān)系分析? ?圖6表明，喀什喀爾與花葉哈什哈爾的遺傳距離為0.821 0，親緣關(guān)系相似系數(shù)為0.28。這說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，為不同品種。

3? ?結(jié)論

利用15對(duì)葡萄基因組SSR標(biāo)記引物對(duì)6組19個(gè)新疆葡萄地方品種植株DNA基因位點(diǎn)的基因型進(jìn)行了測(cè)定與分析。結(jié)果表明，6個(gè)組合每個(gè)組合品種間的親緣關(guān)系差異較大。其中，無(wú)核白近似組合和木納格近似組合的親緣關(guān)系最近，馬奶子近似組合的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，喀什喀爾近似組合次之。

在無(wú)核白近似組合中，5個(gè)品種的親緣關(guān)系相同，可能為同一品種或無(wú)核白及無(wú)核白芽變。在馬奶子近似組合中，馬奶子與夏馬奶關(guān)系近似，其他品種間關(guān)系較遠(yuǎn)，認(rèn)為是不同品種類(lèi)型，可能因果實(shí)性狀類(lèi)似馬奶而命名。和田紅、和田綠、和田黃3個(gè)品種為不同品種。綠木納格和紅木納格可能為同一品種或其中一個(gè)為另一個(gè)的芽變類(lèi)型。無(wú)核白雞心與香妃無(wú)核白雞心為不同品種。喀什喀爾與花葉哈什哈爾為不同類(lèi)型。

本研究?jī)H利用15對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)試驗(yàn)材料對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行了分析，可能存在局限性，下一步需要通過(guò)植物學(xué)和果實(shí)性狀進(jìn)一步驗(yàn)證。