枇杷果酒發(fā)酵過程中理化及風(fēng)味成分分析

單碩，常國立，吳剛正，朱瑞瑜，蔡海鶯，蔡成崗

1. 浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院（杭州 310023）；2. 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心（杭州 310023）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）是我國傳統(tǒng)名果[1]，每年五六月份為盛產(chǎn)的季節(jié)，成熟的枇杷味道甜美柔軟多汁，風(fēng)味酸甜，口味甘甜，肉質(zhì)細(xì)膩，營養(yǎng)頗豐，包括果糖、葡萄糖、鉀、磷、鐵、鈣以及維生素A、B、C等營養(yǎng)成分[2]，其中胡蘿卜素含量在各水果中為第三位。枇杷可以作為藥物使用，具有清肺、止咳、舒氣、解署、益壽等功能，同時(shí)對增進(jìn)食欲，失眠也有一定的療效。但枇杷上市時(shí)間短，不易保鮮，需要進(jìn)行深度加工以發(fā)揮其價(jià)值，制備成發(fā)酵果酒為深加工的方向之一。以新鮮枇杷為原料，接種酵母菌發(fā)酵后可以制備成枇杷酒，含有的胡蘿卜素可以保護(hù)視力，保持肌膚健康；有機(jī)酸類成分可增進(jìn)食欲，幫助消化，多酚類抗氧化成分可預(yù)防癌癥，延緩衰老[3]，同時(shí)還含有豐富的維生素、糖類、鈣、鎂等營養(yǎng)元素。Feng等[4]在桑葚果酒中檢測到31種香味物質(zhì)，其中醛類2種、酸類4種、酯類13種、醇類13種。在發(fā)酵過程中，酵母菌的數(shù)量對發(fā)酵過程影響較大，其快速增殖影響到發(fā)酵液中的風(fēng)味物質(zhì)和酒精含量，對其他發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)也有較大的影響。

此試驗(yàn)通過添加不同比例酵母菌，研究枇杷果酒發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)的變化，以期初步揭示枇杷果酒發(fā)酵過程中主要物質(zhì)的變化規(guī)律，從而為枇杷果酒發(fā)酵過程的控制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷（白沙種，杭州市農(nóng)副產(chǎn)品物流中心）；安琪活性干酵母（當(dāng)?shù)爻校慌Ｑ灏椎鞍住⒖捡R斯亮藍(lán)G-250、甲醇、乙醇、磷酸、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl）、酪氨酸、茚三酮（分析純，阿拉丁生化試劑公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AP-TD55糖度計(jì)（衢州艾普計(jì)量儀器有限公司）；SpectraMax190酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；7890A-5975C氣相質(zhì)譜-質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；TP-350E數(shù)顯磁力加熱攪拌器（杭州米歐儀器有限公司）；ME104E分析天平（梅特勒公司）；SP-752紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；ZZ-SPME-06固相微萃取探針（貞正分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 枇杷果酒制備工藝

枇杷清洗→去核→榨汁→過濾→調(diào)整糖度→酵母活化→接種→發(fā)酵→枇杷果酒→指標(biāo)分析

1.3.2 操作要點(diǎn)

將枇杷去核、破碎打漿后過濾得到枇杷汁，向果汁中添加白砂糖使枇杷果汁糖度達(dá)到200 g/L，以枇杷汁總重1%，3%和5%的比例接入活化好的酵母（20%的蔗糖水溶液300 mL，滅菌冷卻后加入10 g活性干酵母，搖勻靜置30 min），在26 ℃下靜置發(fā)酵。發(fā)酵過程中每5 d取樣測定枇杷果酒中的總糖、可溶性蛋白質(zhì)和氨基酸含量，以DPPH法測定自由基清除率，并采用GC-MS進(jìn)行風(fēng)味成分分析。

1.3.3 總糖檢測

取發(fā)酵果酒，稀釋至合適濃度，采用苯酚硫酸法[5]測定總糖含量（以葡萄糖計(jì)）。回歸方程為y=0.666 2x+0.116（R2=0.996 9），如圖1所示。

圖1 總糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 可溶性蛋白的檢測

可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法[6]。回歸方程為y=0.333 9x-0.003 8（R2=0.999 1），如圖2所示。

圖2 可溶性蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.5 氨基酸檢測

氨基酸總量以茚三酮比色法進(jìn)行定量[7]，標(biāo)準(zhǔn)曲線以酪氨酸進(jìn)行測定。回歸方程為y=0.333 9x-0.003 8（R2=0.999 1），如圖3所示。

圖3 游離氨基酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.6 DPPH自由基清除率分析

DPPH清除率參考文獻(xiàn)[8]的方法，稍作修改。將40 μL樣品加去離子水至2 mL，再加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，再加入450 μL 0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），在25 ℃水浴鍋中保溫0.5 h。以維生素C為對照，以蒸餾水為參比，測試波長517 nm的吸光度，按式（1）計(jì)算。

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

1.3.7 枇杷酒發(fā)酵過程中香氣成分的檢測方法

樣品吸附之前先將固相萃取頭高溫活化30 min，至無色譜峰出現(xiàn)為止。量取3 mL枇杷酒樣于5 mL頂空瓶中，插入固相微萃取裝置露出萃取頭，保證剛好置于液面上方，將其放在溫度為50 ℃的磁力攪拌器中30min，萃取結(jié)束后立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口。

1.3.8 氣相色譜條件

采用了王錦濤[9]的方法，稍作修改。色譜條件：色譜柱為TG-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；1.0 mL/min氦氣（99.999%）為載氣；進(jìn)樣口溫度設(shè)定為260 ℃，15 min解析，分流比設(shè)定為10∶1。色譜柱升溫程序：起始溫度為40 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min的速度升溫至200 ℃，保持1 min，再以10℃/min的速度升溫至230 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：70 eV的EI離子源，溫度為280 ℃，掃描范圍為35～400 AMU，燈絲流量為0.25 mA，檢測器電壓為350 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷果酒發(fā)酵過程中葡萄糖的變化

由圖4可知，接種不同比例酵母的枇杷果酒中的葡萄糖在前5 d迅速下降，后緩慢下降直至平衡，隨著發(fā)酵進(jìn)程，酵母能利用的糖類物質(zhì)逐步減少，最終趨于平衡。添加5%的酵母菌總糖含量略高，可能是由于加入菌種時(shí)糖含量較高，并且酵母在發(fā)酵后期可能存在自溶現(xiàn)象，細(xì)胞壁多糖等成分溶解在枇杷酒后對總糖含量有一定的影響。

圖4 發(fā)酵過程總糖的變化

2.2 枇杷果酒發(fā)酵過程中可溶性蛋白質(zhì)的變化

由圖5可知，發(fā)酵前5 d可溶性蛋白質(zhì)無明顯變化，在5～10 d迅速下降，可溶性蛋白質(zhì)作為氮源被酵母菌消耗，10 d后基本達(dá)到穩(wěn)定。

圖5 發(fā)酵過程中可溶性蛋白含量的變化

2.3 枇杷果酒發(fā)酵過程中游離氨基酸的變化

由圖6能看出，發(fā)酵10 d后枇杷果酒中游離氨基酸開始呈現(xiàn)增加趨勢，可能是因?yàn)榻湍冈诎l(fā)酵過程中利用蛋白質(zhì)產(chǎn)生部分氨基酸，至發(fā)酵20 d后氨基酸又呈現(xiàn)增加趨勢，可能是由酵母自溶所致。

圖6 發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化

2.4 枇杷果酒發(fā)酵過程中DPPH的變化

由圖7可知，DPPH清除率總體呈下降趨勢，表明隨發(fā)酵進(jìn)行枇杷果酒的抗氧化性減弱，有研究表明，DPPH自由基清除能力也呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵時(shí)間40 h時(shí)達(dá)到最大[10]，試驗(yàn)發(fā)酵周期長，DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)下降趨勢，跟發(fā)酵過程中營養(yǎng)物質(zhì)減少進(jìn)而影響發(fā)酵進(jìn)程有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致DPPH自由基清除率隨發(fā)酵時(shí)間的增加而下降。

圖7 發(fā)酵過程中DPPH清除率的變化

2.5 枇杷果酒發(fā)酵過程中風(fēng)味成分分析

2.5.1 不同發(fā)酵時(shí)期枇杷酒風(fēng)味成分的總離子流圖

枇杷酒發(fā)酵樣品的總離子圖如圖8所示。在發(fā)酵過程中枇杷酒的香氣成分變化很豐富，不同物質(zhì)的分離度、峰形、離子峰度均較好。

圖8 發(fā)酵25 d枇杷酒香氣的總離子流圖

2.5.2 不同發(fā)酵時(shí)期枇杷酒風(fēng)味成分及其相對含量

不同發(fā)酵時(shí)期枇杷酒中的主要風(fēng)味物質(zhì)如表1所示。由表1可知，不同發(fā)酵時(shí)期的香氣成分主要為酯、醇、醛3大類，包括苯甲醛、乙醇、苯乙醇、1-庚醇、2-甲基-1-丙醇、3-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基1-丁醇，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等。由此表明，在枇杷果酒發(fā)酵期間，香氣變化的同時(shí)保持前后的一致性，與蒲彪等[11]研究結(jié)果在多種成分上有一定的相似性。

表1 不同時(shí)期不同酵母接種量枇杷酒主要香氣成分及其相對含量

2.5.3 不同發(fā)酵時(shí)期不同濃度枇杷酒香氣成分分析

枇杷酒中香氣成分按化合物結(jié)構(gòu)分為醇類、酯類、酚類、醛類。枇杷酒中各類香氣成分的相對含量高低依次均為醇類、酯類、醛類，其中又以醇類和酯類的相對含量較高，不同發(fā)酵時(shí)期以及添加不同量的酵母菌對三大類風(fēng)味成分的影響如圖9所示。在發(fā)酵第5天時(shí)，添加1%，3%和5%的酵母后，枇杷酒中的醇類成分差異不明顯，酯類成分以3%和5%酵母添加量影響較大，說明酵母數(shù)量多促進(jìn)了酯類成分的形成；在發(fā)酵第15天時(shí)，不同酵母添加量的枇杷酒中醇類物質(zhì)含量存在了明顯的區(qū)別，說明了酵母添加量高促進(jìn)了更多的醇類物質(zhì)生成；在發(fā)酵第25天時(shí)，三組發(fā)酵枇杷酒中的醇類物質(zhì)含量在同一水平。此試驗(yàn)中醇類物質(zhì)含量較高，對枇杷酒口味影響較大；張麗萍等[12]也報(bào)道醇類物質(zhì)對枇杷酒香氣的貢獻(xiàn)最大。

圖9 不同發(fā)酵時(shí)期以及添加不同量的酵母菌對三大類風(fēng)味成分的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過比較不同酵母接種量以及不同發(fā)酵時(shí)期枇杷果酒理化與風(fēng)味成分的變化，以期為枇杷酒的釀制提供一定的基礎(chǔ)。試驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵過程中，總糖含量逐步呈現(xiàn)下降的趨勢，后期略有升高；可溶性蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵10 d后即進(jìn)入達(dá)到穩(wěn)定；游離氨基酸含量同樣在10 d后達(dá)到一個(gè)轉(zhuǎn)折性的變化，即含量明顯開始隨發(fā)酵上升，部分試驗(yàn)的結(jié)果可能涉及酵母菌在發(fā)酵過程中營養(yǎng)不足時(shí)出現(xiàn)的自溶現(xiàn)象。DPPH自由基的清除效果隨著發(fā)酵過程逐步下降。發(fā)酵枇杷酒風(fēng)味獨(dú)特，通過GC-MS分析發(fā)現(xiàn)以醇、酯類化合物為主要香氣成分，不同發(fā)酵階段醇類物質(zhì)隨著添加酵母的不同量有一定變化，最終處于同一水平，因而需要對添加不同酵母菌濃度后枇杷酒發(fā)酵的時(shí)間和進(jìn)程進(jìn)行控制，以期獲得風(fēng)味更好的枇杷酒產(chǎn)品。綜上，枇杷為我國南方特色水果，儲(chǔ)存期短，發(fā)酵制備的枇杷酒風(fēng)味獨(dú)特，研究通過釀造過程中理化指標(biāo)和風(fēng)味的變化分析，為枇杷酒的其進(jìn)一步規(guī)模化開發(fā)提供了一定思路。