胡桃楸果實表型性狀及遺傳多樣性分析

王子豪，蘇迅，解孝滿，仝伯強，丁平，韓彪，劉丹，張萍，孔冬瑞，胡德昌

(1. 魯東大學生命科學學院，山東煙臺 264025；2. 山東省林草種質資源中心，山東濟南 250014)

胡桃楸(Juglans mandshuricaMaxim.)為胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(JuglansL.)植物，又稱核桃楸、野核桃，是一種高大溫帶落葉喬木，常作材用，與水曲柳和黃波羅并稱東北地區三大闊葉樹種，且種仁可食[1，2]。 作為核桃的近緣種，與栽培核桃雜交育種、用作核桃砧木等成為近年胡桃楸研究的熱點[3-5]。 另外，Xu 等[6]揭示了核桃青皮酚類物質能夠有效抵御膠孢炭疽菌，對下一步開發植物源核桃炭疽病綠色防控農藥具有重要意義。 因此，對胡桃楸進行相關研究具有巨大實際應用潛力。

果實作為繁殖器官，與葉片等營養器官相比特征相對穩定，能在不同地理位置、復雜多變的環境下表現出較強的適應性，能較好地體現進化上的變異規律。 陳思羽等[7]發現分布在長白山不同區域的核桃楸，種子質量、種子長度和種子寬度等性狀變異明顯。 宋佳興等[8]將遼東山區胡桃楸種質資源的果實根據表型性狀劃分為球形、卵形等十余種果實形態，變異類型豐富。 高張瑩等[9]認為不同種群間核桃楸果核性狀存在極顯著差異，主要受生境因子影響，但也受到很強的遺傳控制，基于表型性狀數據的聚類結果與地理分布并不完全一致，呈現隨機變異特征。 李紅莉等[10]研究得知黑龍江野生毛榛果實表型性狀多樣性豐富。 張深梅等[11]調查發現大別山19 個核桃野生居群的果實表型性狀在居群間和居群內均存在極顯著差異，具有豐富的表型變異。 董勝君等[12]發現東北杏的果實性狀變異較為豐富，且變異主要來源于居群間。 王堯等[13]研究得知山東省鹽膚木果實表型性狀多樣性較為豐富，變異以居群間變異為主，而且受地理位置影響明顯，可作為鹽膚木優質種源篩選的重要指標。 可見，以果實作為試驗材料能更直觀地反映胡桃楸各個居群間的表型差異。

胡桃楸主要分布于我國東北及華北地區，然而近幾年的資源普查發現山東省的泰山、仰天山、昆崳山等地也有部分自然種群分布，呈現狹域分布格局。 目前，該物種已被列為山東省珍稀瀕危植物，相關的物種保護工作也已開展[14-16]。 由于個體數量少且結實率低、嚙齒類動物取食以及人為采集等因素影響，獲取一定數量的群體樣本和果實材料相對困難，這導致胡桃楸種質資源相關研究甚少。 前期研究結果表明，各居群胡桃楸存在一定程度的表型性狀分化，遺傳背景不明確。因此，為探究不同種源地胡桃楸果實變異規律及造成其形態學特征差異的原因，本研究采集山東地區3 個生境的地理居群以及胡桃楸原生地吉林地區的長白山居群共13 個單株的289 枚胡桃楸果實，測定其表型性狀，并通過差異性、相關性及聚類分析研究其變異程度，同時，基于ITS 區域測序獲得的生物學信息檢測其遺傳多樣性水平，挖掘各居群的遺傳背景，以期為胡桃楸種質資源的分類鑒定、物種保護、資源圃建立以及核桃新品種選育等提供參考。

1 材料與方法

1.1 果實材料采集

本試驗對山東地區胡桃楸主要居群泰山居群(TS，117.10°E、36.25°N，山東泰安)、仰天山居群(YTS，118.45°E、36.71°N，山東濰坊)、昆崳山居群(KYS，121.74°E、37.30°N，山東煙臺)以及吉林地區長白山居群(CBS，121.08°E、38.46°N，吉林延邊)分別進行單株取樣；居群內各供試植株相距100 m 以上，以避免克隆單株。 于2021 年9 月底到10 月初果實成熟期采集成熟果實，分別編號并帶回實驗室，人工剝離青皮獲得內果實，蒸餾水清洗干凈后，置于通風良好處室溫條件下風干，然后裝入自封袋保存備用。

共收集到4 個胡桃楸居群13 個單株的289枚果實(表1)。 由于結實數量存在差異，從各單株采集的果實數量不同，部分單株已達取樣極大值。 其中，泰山居群6 個單株140 枚果實，仰天山居群2 個單株60 枚果實，昆崳山居群2 個單株46枚果實，長白山居群3 個單株43 枚果實。

表1 試驗材料

1.2 DNA 提取

于各供試單株上分別采集成熟葉片3 ～5 枚，迅速置入盛有變色硅膠的封口塑料袋內帶回實驗室。 隨機抽取泰山居群的4 個單株、仰天山居群的2 個單株、昆崳山居群的2 個單株、長白山居群的3 個單株共計11 份材料進行ITS 區域測序分析。 應用CTAB 法進行DNA 提取，并通過紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度及質量，-20℃保存備用。

1.3 果實表型性狀數據獲取與統計分析

使用游標卡尺(精準度±0.2 mm)測量胡桃楸果實的橫徑(垂直于縱軸無棱處最大橫截面的長度)、側徑(垂直于縱軸的2 條縱棱之間的長度)與縱徑(果實縱軸的長度)，精確到0.001 mm，并計算果型指數(果型指數＝縱徑/橫徑)，果型指數0.9～1.1 為圓形，＞1.1 ～≤1.5 為橢圓形，＞1.5 為長橢圓形。 人工觀察判斷果核尖端類型、表面紋飾、縱脊數目等特征，果核尖端類型分為長尖、漸尖、無尖三種，表面溝紋分為深、淺兩種。

運用Microsoft Excel 2016 軟件進行數據處理，采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。 不同居群果實表型性狀差異采用單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan’s 最小顯著差異法進行多重比較，顯著、極顯著水平分別設置為0.05、0.01；將數據進行標準化轉換，采用組間聯結-系統聚類法，以歐式平方距離進行聚類分析；采用Pearson 法進行相關性分析。

變異系數CV ＝S/X×100%，其中S 為性狀標準差，X 為性狀平均值；

相對極差RR ＝(Xmax- Xmin)/X×100%，其中Xmax、Xmin分別為性狀最大、最小值；

居群遺傳力H2＝1-1/F，其中F 為方差分析中的F 檢驗值；

三徑均值D＝(D縱徑+D橫徑+D側徑)/3；

果實體積V＝4/3π(1/2D)3。

1.4 ITS 片段PCR 擴增與數據分析

應用PCR 技術特異擴增11 份胡桃楸材料相關ITS 片段，并進行序列分析，獲得遺傳信息，檢測變異程度。 引物序列(ITS4:5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC - 3＇； ITS5: 5＇ - GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3＇)、擴增體系及擴增程序參考張浩[17]的方案。 引物合成及所獲得的PCR 產物單向測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。 利用MEGA-X 軟件對序列信息進行比對，分別計算各片段的堿基含量、變異位點數目、簡約性信息位點等信息。 運用DNAsp 5 軟件計算ITS 序列單倍型多樣性指數(Hd)、核苷酸多樣性指數(Pi)以及平均核苷酸多樣性差異(K)等相關遺傳多樣性指數；應用Arlequin 3.5 軟件對ITS 區域遺傳信息進行分子方差(AMOVA)分析，計算其遺傳分化系數(FST)及基因流(Nm)，檢測胡桃楸居群內和居群間的遺傳變異關系。

2 結果與分析

2.1 不同居群胡桃楸果實表型性狀差異性分析

如圖1 所示，山東地區不同居群胡桃楸果實表面紋飾均較淺，多為8 個縱脊、具長尖(僅泰山居群17 枚果實具漸尖和無尖)，而吉林地區長白山居群多為表面紋飾較深、8 個縱脊、具長尖。 經比較，所收集的泰山居群果實體積中等，果型變化豐富，140 枚果實中，57.9%(81 枚)為橢圓形，30.0%(42 枚)為長橢圓形，12.1%(17 枚)為圓形；仰天山居群胡桃楸果實體積偏大，51.7%(31枚)為橢圓形，48.3%(29 枚)為長橢圓形；昆崳山居群果實體積整體較小，84.8%(39 枚)為橢圓形，15.2%(7 枚)為長橢圓形；長白山居群胡桃楸果實體積最大，32.6%(14 枚)為橢圓形，67.4%(29 枚)為長橢圓形。

4 個居群胡桃楸果實的橫徑、側徑、縱徑、果型指數、三徑均值、體積變幅分別為1.85 ～3.15 cm、1.89～3.25 cm、2.17 ～5.17 cm、1.00 ～2.13、2.03 ～3.96 cm、4.38～32.50 cm3，平均值分別為2.39 cm、2.51 cm、3.34 cm、1.40、2.77 cm、11.56 cm3，變異系數在7.56%～36.07%之間，經F 檢驗居群間差異均達極顯著水平(P＜0.01)，遺傳力分別為0.93、0.97、0.98、0.97、0.98、0.98(表2)，推斷這些果實表型性狀受較強的遺傳特性控制，居群間差異相對穩定。

表2 不同居群胡桃楸果實表型性狀統計分析結果

不同居群中，各單株果實表型性狀的變化程度存在差異。 對比果型指數，CBS 與YTS 居群內個體間無顯著差異，果實性狀相似度較高；極值(最大2.14，最小0.93)均出現在TS 居群材料內，說明該居群個體間差異明顯，果實類型最為豐富，其中TS01 與TS02、TS05 單株之間差異顯著，TS03、TS04、TS06 之間差異不顯著。

2.2 胡桃楸果實表型性狀間的相關性分析

由表3 可知，胡桃楸果實的橫徑、側徑、縱徑、體積、三徑均值間均呈極顯著正相關關系，果型指數與果實縱徑、三徑均值、體積均極顯著正相關，表明果實橫徑、側徑、縱徑的變異具有互相適應的協同變化特征。

表3 胡桃楸果實表型性狀間的相關性系數

2.3 基于果實表型性狀的不同居群胡桃楸材料聚類分析

根據胡桃楸果實表型性狀數據，運用歐氏距離類平均法進行聚類分析，結果(圖2)顯示，在歐氏距離25.0 處，可將胡桃楸居群分為2 組，第1組包括 CBS01、 CBS02、 CBS03、 TS01、 TS04、YTS01、YTS02，第2 組包括TS02、TS03、TS05、TS06、KYS01、KYS02。 可見泰山居群內多樣性更豐富，呈現一定程度的分化，分別與長白山居群、昆崳山居群有一定程度的相似。 供試材料間歐氏距離相對較小，相互混雜，推斷山東地區胡桃楸不同居群間以及與長白山居群間存在著基因交流。

圖2 基于歐氏距離構建的不同居群胡桃楸果實表型特征聚類圖

2.4 基于ITS 序列的不同居群胡桃楸遺傳分析

由表4 可見，YTS 居群的Hd、Pi、K 值均為零，其余3 個居群的Hd 均為1.000、Pi 和K 均表現為CBS＞KYS＞TS，表明YTS 居群遺傳多樣性水平最低，TS 和KYS 居群遺傳多樣性相對偏高，CBS 居群遺傳多樣性最高。 測序信息經比對后，不同材料的堿基變異位點無明顯規律，呈現隨機變化。 綜合上述結論，果實表型性狀分析結果與遺傳分析結果基本一致。 因此，推斷山東地區3個胡桃楸居群以及東北地區CBS 居群各個體的表型性狀與遺傳背景存在一定程度的相關性。

表4 基于ITS 序列的胡桃楸居群遺傳多樣性

由遺傳距離分析結果(表5)可知，4 個胡桃楸居群間遺傳距離普遍較小(0.001～0.048)，平均值為0.027，其中TS 與KYS 居群遺傳距離相對較遠，呈現最大遺傳距離(0.048)；而TS 與YTS 居群遺傳距離相對較近，遺傳距離最小(0.001)。CBS 居群與TS、YTS、KYS 居群地理距離較遠，但居群間遺傳距離較小，表明各胡桃楸居群間的遺傳距離與地理距離間未表現明顯的相關性。

表5 基于ITS 序列的胡桃楸居群間遺傳距離

應用Arlequin 3.5 軟件對ITS 區域遺傳信息進行分子方差(AMOVA)分析，結果(表6)顯示該物種群體總遺傳變異中有41.99%發生在居群內，58.01%的變異發生在居群間。 3 個胡桃楸居群間的遺傳分化系數FST為0.665，居群間基因流Nm較大，為1.93，表明胡桃楸居群間存在基因交流。

表6 胡桃楸居群ITS 序列AMOVA 分析

3 討論與結論

植物個體的表型性狀是基因型與環境共同作用的結果。 變異系數越大說明對環境適應性越強，變異系數小則說明性狀相對穩定，遺傳穩定性較好，不易受到環境等因素的影響。 胡桃楸果實體積、形狀等相關指標均屬于數量性狀，與個體生長的立地生境和樹木生理年齡等因素存在一定相關性。 于國斌[18]發現東北地區胡桃楸果實存在豐富的變異類型，不同種源地的胡桃楸果實橫徑、縱徑、側徑之間有顯著性差異，推斷變異類型受多種環境因素影響。 Cosmulescu 等[19]對核桃屬J.regia的堅果形態學特征進行比較后認為所觀察的性狀變異可能是由農業氣候條件和果實自身繁殖特性引起。 本研究結果表明，胡桃楸果實6 個表型性狀的變異系數在7.56%～36.07%之間，在居群間存在極顯著差異，4 個居群的地理位置、氣候條件和種群大小存在較大差異可能是導致其果實性狀變異的主要原因；另外，泰山居群的果實類型最為豐富，表明居群內的單株間也存在一定程度的遺傳變異；與逄宏揚等[20]的研究結果一致，本研究也發現胡桃楸果實橫徑、側徑、縱徑之間存在極顯著正相關關系，表明這三個性狀間具有互相適應的協同變化特征。 豐富的形態多樣性可為后期進行胡桃楸資源收集和種質保存提供研究基礎。

聚類分析結果顯示，泰山居群胡桃楸果實表型性狀呈現一定程度的分化，分別與長白山和仰天山居群、昆崳山居群的果實表型較為相似，而且居群間遺傳距離較小，判斷可能存在著基因交流；而仰天山居群與昆崳山居群間表型性狀差異較大，未聚在一起。 表明這4 個居群的胡桃楸果實形態特征呈現片斷化分布，這與高張瑩等[9]的核桃楸果核形態特征在部分地區呈現區域板塊化特征的結論一致。

當遺傳基礎較窄時，為適應復雜的生態環境，物種的表型性狀有可能會隨著外界環境條件的變化而產生與之相適應的遺傳變異。 宋佳興等[8]調查發現立地條件相對一致的胡桃楸果實表現出豐富的變異類型，推斷胡桃楸種群具有豐富的遺傳多樣性。 高張瑩等[9]研究發現東北到華北天然分布的9 個核桃楸種群間果核性狀存在極顯著差異，且各性狀的遺傳力均大于0.9，受到很強的遺傳控制，各表型性狀并未完全按地理距離而聚類。 本研究基于ITS 序列分析結果顯示，山東地區的仰天山居群遺傳多樣性水平最低，泰山居群、昆崳山居群和長白山居群遺傳多樣性相對偏高；基于形態學特征分析的結果也表明仰天山居群果實表型性狀較為單一，泰山居群的性狀變異相對豐富。 兩方面分析所得結論基本一致，推斷胡桃楸果實表型性狀的差異是其適應不同生境條件的方式之一，且這種變異是不連續的，可能受遺傳多樣性影響。 因此，若要完全闡明胡桃楸果實表型變異規律，還需進一步擴大種質資源的收集范圍，并結合分子手段對其遺傳多樣性和親緣關系等進行深入研究。