妊娠早期亞臨床甲狀腺功能減退孕婦外周血Th1、Th2、Th17、Treg及細胞因子變化研究*

劉偉平，宋耀輝，鐘輝秀，章梁君，隆 霞，殷明剛

自貢市第一人民醫院 檢驗科（自貢 643000）

亞臨床甲狀腺功能減退（subclinical hypothyroidism，SH）是妊娠期最常見的甲狀腺疾病，其患病率為2%～5%[1]。SH診斷依據是血清促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）升高但甲狀腺素（thyroxine，T4）水平正常[2]。有研究[3]表明，SH與不孕癥、不良妊娠和新生兒不良結局風險增加有關，還可能導致后代神經認知缺陷風險增加；妊娠早期（T1 期，妊娠12 周內） SH與妊娠并發癥、胎兒發育不良等因素密切相關。

T淋巴細胞在免疫應答中發揮著重要作用，如輔助性T細胞1（Th1）主要參與細胞免疫應答，分泌產生白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）；而輔助性T細胞2（Th2） 主要參與體液免疫應答，分泌產生白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-6（IL-6）[4]。輔助性T細胞17（Th17）是獨立于Th1 型和Th2 型的細胞亞群，屬于CD4＋T細胞，可特異性產生白介素-17（IL-17）[5]。同時Th17參與多種自身免疫性疾病的發生過程。CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory cells，Treg）是維持外周耐受的重要細胞，Treg細胞通過產生免疫抑制細胞因子白細胞介素-35（IL-35）和轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），來抑制幼稚的T細胞活化并防止效應T細胞的過度功能，在調節免疫和誘導免疫耐受方面發揮著核心作用[6-7]。Th17 細胞及其他效應 T 細胞的活性會被 Treg 細胞抑制，Th17細胞的功能受 Treg細胞的調節[8]。Foxp3 是Treg細胞的主轉錄因子，并保持其特定的特征和功能。Th17/Treg兩種細胞亞群的表達水平失衡與多種自身免疫性疾病密切相關[9]，但Th17/Treg及其相關細胞因子的表達水平在妊娠早期SH發病過程中的臨床意義尚未明確[10]。本研究旨在探討妊娠早期SH孕婦外周血中Th1、Th2、Th17 和Treg細胞的表達并分析其可能的臨床意義，以期為臨床妊娠早期SH的診治及干預提供新型標志物和治療靶點，以達到優生優育的目的。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年11月至2020年4月在自貢市第一人民醫院就診建卡的妊娠早期SH患者30 例作為試驗組，選取同期在該院就診建卡的正常孕婦30 例作為對照組。SH患者納入標準：2012 版《妊娠和產后甲狀腺疾病診治指南》妊娠T1 期（妊娠12 周內）； TSH＞2.5 mIU/L、T4水平正常[11]。排除標準：罹患其他內分泌系統疾病、心血管疾病、腫瘤、腎臟病、感染性疾病、自身免疫性疾病者。本研究通過自貢市第一人民醫院倫理委員會審批（No：2018 第63 號），患者知情同意。兩組患者在年齡、孕周、體重指數（body mass index，BMI）、腹圍和血壓值方面比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表 1 兩組一般資料比較[，M（Q1，Q3），n=30]

表 1 兩組一般資料比較[，M（Q1，Q3），n=30]

注：1 mm Hg=0.133 kPa。

組別年齡/歲孕周/周BMI/（kg/m2）腹圍/mm收縮壓/（mm Hg） 舒張壓/（mm Hg）試驗組29.01±5.047.63（6.21，10.34） 19.33（17.94，20.75） 78.12（75.20，80.31）104.21±6.9272.52±7.02對照組29.32±5.357.97（6.19，10.25） 19.53（19.14，20.16） 78.30（75.23，80.12）105.15±7.0571.96±7.31 t/Z0.4060.6250.3961.0210.4030.164 P 0.7010.2530.7240.1600.7131.725

表 2 兩組甲狀腺功能及相關指標比較[，M（Q1，Q3），n=30]

表 2 兩組甲狀腺功能及相關指標比較[，M（Q1，Q3），n=30]

組別T3/（μg/L）T4/（μg/L）fT3/（ng/L）fT4/（ng/L）TSH/（mIU/L）TPOAb/（×103 IU/L）試驗組1.39±0.28122.7±17.42.56±0.310.73±0.153.61（3.11，4.32）0.42（0.21，1.49）對照組1.45±0.27120.4±16.62.59±0.340.78±0.9341.14（0.63，1.46）0.23（0.19，0.31）t/Z0.6540.2510.3791.1089.3512.326 P 0.5430.9220.7420.120＜0.0010.039組別TGAb /（×103 IU/L）WBC/（×109 個/L）RBC/（×1012 個/L）Hb/（g/L）Neu/%Lym/%試驗組0.22（0.13，0.46）7.95±1.883.92±0.57118.90±11.1871.87±6.2519.55±5.33對照組0.21（0.09，0.57）7.52±2.074.08±0.61121.35±11.0769.31±7.6920.85±6.17 t/Z0.2502.1622.5873.2153.2162.952 P 0.9240.0440.0130.0030.0030.006

1.2 試劑及儀器

CD3（PC7，批號：536335），CD4（APC，批號：7536335），CD25（ECD，批號：200044），CD45（FITC，批號：7536335），Foxp3（PE，批號：200017），IL-17（PC5.5，批號：B437457），IFN-γ（FITC，批號：200017），IL-4（PE，批號：B325120）流式熒光抗體及流式細胞儀均來源于 美國Beckman 公司；紅細胞裂解液和細胞刺激劑來源于美國BD公司；細胞培養液來源于美國Hyclone公司；Th1、Th2、Th17細胞固定劑、Treg染色固定劑和破膜劑均購自美國Invitrogen公司，細胞培養箱購自德國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 Th1、Th2、Th17 流式細胞術檢測方法 參考文獻[10]和儀器試劑說明書進行操作，取 100 μL乙二胺四乙酸二甲（EDTA dipotassium salt，EDTA-2K）抗凝全血，加入 3 mL 生理鹽水，相對離心力300 g，離心 5 min，洗滌。每管加入 RPMI1640 培養液 100 μL 后加入 2 μL 細胞刺激劑，放入 37 ℃、5% CO2培養箱中培養 6 h 后加入 CD3 和 CD4 抗體各 5 μL，避光孵育 15 min。加入 50 μL 固定劑 A 液孵育 15 min，加 2 mL 生理鹽水，相對離心力300 g，離心 5 min，洗滌。棄上清后加入 50 μL 破膜劑 B 液，分別加入 IFN-γ、IL-4、IL-17 抗體各 5 μL，孵育30 min。加入1 mL生理鹽水，相對離心力300 g ，離心 5 min后洗滌；加入 300 μL 鞘液，上機檢測。Th1、Th2、Th17 水平分別以IFN-γ/CD4、IL-4/CD4、IL-17/CD4 表示。

1.3.2 Treg細胞流式細胞術檢測方法 參考文獻[10]和儀器試劑說明書進行操作，取流式反應管加入 5 μL 不同熒光標記的 CD4、CD25 混合抗體，然后加入 50 μL 全血，室溫避光孵育 30 min。加入 1 mL重懸液，于相對離心力300 g，離心 5 min，去上清，加入500 μL固定劑，孵育30 min后加入800 μL 破膜緩沖液，同上離心，洗滌。棄上清后加入50 μL 破膜緩沖液，同時加入5 μL的Foxp3抗體，孵育30 min。加入 1 mL 生理鹽水，同上離心，洗滌，棄上清，加入 300 μL 的重懸液，上機檢測。Treg細胞以Foxp3/CD4+表示。流式數據分析及作圖使用Kaluza 2.1軟件。

1.3.3 血清細胞因子檢測方法 采用酶聯免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-17、TGF-β1 和IL-35 水平，檢測使用ELISA試劑盒（武漢Boster 生物工程有限公司），根據說明書測定以上血清細胞因子水平。IL-2、IFN-γ、IL-17和 TGF-β1 檢測下限均為1.0 ng/L，IL-4、IL-6 的檢測下限分別為1.50 ng/L和0.30 ng/L，IL-35的檢測下限為76.93 ng/L。

1.4 統計學方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0 統計軟件處理數據。符合正態分布的定量資料采用（）描述，兩組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的定量資料采用M（Q1，Q3）描述，組間比較采用秩和檢驗。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 兩組甲狀腺功能及相關指標比較

試驗組TSH和抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）、白細胞（WBC）、中性粒細胞百分比（Neu%）水平均高于對照組（P＜0.05）；紅細胞計數（RBC）、血紅蛋白（Hb）、淋巴細胞百分比（Lym%）水平均低于對照組（P＜0.05）。三碘甲狀腺原氨酸（T3）、游離三碘甲狀腺原氨酸（fT3）、游離甲狀腺素（fT4）等指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

2.2 兩組Th1、Th2、Th17 和Treg 細胞的表達水平比較

試驗組Th1 表達水平高于對照組，Th2 表達水平低于對照組（P＜0.05）。試驗組Th1/Th2、Th1/Th17及Th17/Treg比值高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組間Th17 和Treg表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表3）。

表3 兩組Th1、Th2、Th17 和Treg細胞的表達水平比較[，M（Q1，Q3），n=30]

組別CD4/%IFN-γ/CD4/%IL-4/CD4/%IL-17/CD4/%試驗組38.67±6.6427.32±10.192.62±1.201.63（1.23，2.59）對照組38.01±6.2520.97± 9.923.71±1.271.55（1.27，2.18）t/Z-0.397-3.0842.7521.077 P 0.7620.0060.0180.101組別Foxp3/CD4+/%Th1/Th2Th1/Th17Th-17/Treg試驗組0.89（0.56，1.24）11.20（7.44，14.72）18.78（11.65，26.42）2.24（1.24，3.47）對照組0.96（0.62，1.37）5.91（4.25，11.31）10.38（ 7.09，22.20）1.19（0.98，1.93）t/Z-1.7453.4573.4602.931 P 0.0780.0020.0020.016

2.3 兩組Th1、Th2、Th17 和Treg 細胞分泌相關細胞因子水平比較

試驗組血清中IFN-γ、 IL-17、IL-6、IL-35 的水平高于對照組（P＜0.05）；IL-4、TGF-β水平低于對照組（P＜0.05）。試驗組血清中IFN-γ/IL-4、IL-17/TGF-β、IL-6/TGF-β、IFN-γ/IL-17 比值高于對照組（P＜0.05）。IL-2、IL-17/IL-35、IL-6/IL-35 水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 兩組Th1、Th2、Th17 和Treg細胞分泌相關細胞因子水平比較[，M（Q1，Q3），n=30]

表4 兩組Th1、Th2、Th17 和Treg細胞分泌相關細胞因子水平比較[，M（Q1，Q3），n=30]

組別IFN-γIL-2IL-4IL-6IL-17IL-35TGF-β試驗組16.10±8.2753.27±30.1836.37（26.21，47.08） 46.37（26.75，73.47） 24.27（19.37，25.92） 65.31（46.74，77.81）381.4（314.50，435.00）對照組10.47±7.1854.62±29.2144.56（27.75，62.90） 30.14（17.33，42.21） 19.77（15.39，24.06） 44.88（41.57，50.87）469.5（438.57，495.30）t/Z4.2540.245-2.1573.0272.5122.752-6.044 P＜0.0010.8120.0370.0030.0210.006＜0.001組別IFN-γ/IL-4IL-17/TGF-βIL-17/IL-35IL-6/TGF-βIL-6/IL-35IFN-γ/IL-17IFN-γ/IL-6試驗組0.46（0.31，0.62） 0.09（0.07，0.14）0.42（0.28，0.60）0.09（0.07，0.16）0.71（0.43，1.29）0.59（0.54，0.92）0.34（0.18，0.62）對照組0.21（0.16，0.37） 0.03（0.02，0.07）0.44（0.31，0.58）0.06（0.04，0.09）0.69（0.39，0.88）0.40（0.26，0.82）0.32（0.15，0.54）t/Z4.3003.285-0.4033.6471.0402.6780.791 P＜0.0010.0170.7230.0010.0640.0350.410

3 討論

母體免疫系統在懷孕期間可產生獨特的免疫學挑戰，母體對半同種異體的胎體可以耐受[12]。輔助性T細胞（簡稱Th細胞）在調節免疫反應中起著關鍵作用，各種Th細胞亞群在人類妊娠每個階段均發揮著不同的生物學作用。研究[13]表明，妊娠初期輕微而短暫的甲狀腺功能減退對子代的生長發育有一定影響，即使接受左甲狀腺素補充治療，依然難以完全逆轉。因此探尋妊娠早期SH相關細胞和分子標志物，對于孕婦SH的早診斷和早干預，實現優生優育具有重要意義。

本研究發現，試驗組患者外周血WBC和Neu%水平高于對照組（P＜0.05），RBC、Hb、Lym%水平低于對照組（P＜0.05），可能與甲狀腺激素對血液系統血細胞的生成和發育具有重要影響有關。SH患者早期甲狀腺功能異常可導致外周血WBC、RBC、血小板系發生異常的風險明顯增加，其中以RBC和Hb降低為主，潛在原因可能與SH患者體內血清鐵、維生素B12 及葉酸水平降低相關[14]，說明外周血WBC、RBC、Hb及Neu%、Lym%的測定可作為孕早期SH診斷的輔助指標，這與毛艷玲等[15]研究結果相符。

本研究通過測定外周血 Th1、Th2、Th17 和 Treg細胞的數量以及血清細胞因子的水平探討孕早期SH孕婦免疫調節和免疫效應之間的平衡關系。結果顯示，與孕早期正常孕婦相比，同時期SH孕婦外周血中Th1 的表達水平升高，而Th2 的表達水平降低（P＜0.05）。同時，孕早期SH孕婦血清中IFN-γ的水平升高，而IL-4 水平降低（P＜0.05）。IFN-γ/IL-4 比值明顯升高（P＜0.05），這說明孕早期SH患者外周血中Th1/Th2 失衡，Th1 細胞數量增多，而Th2 細胞數量減少。有研究[16]指出，Th1/Th2 失衡的胎盤微環境可使自噬受損和細胞凋亡增加，可能是導致自發性早產的發病機制之一。動物實驗[12]表明，給予過量的Th1型細胞因子如 IL-2或IFN-γ可刺激Toll樣受體（TLR） ，誘導Th1 型細胞因子的產生，從而導致流產。此外，IFN-γ在小鼠妊娠早期的血管重塑中也發揮著重要作用[17]。本研究結果表明，孕早期SH患者外周血中Th1/Th2失衡，且比值升高，可能會導致孕婦自發性早產、流產和先兆子癇等妊娠不良結局。

本研究結果顯示，與對照組比較，試驗組外周血中Th17 明顯升高，導致Th17/Treg比值升高；血清中IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-35、IL-17/TGF-β、IL-6/TGF-β水平升高，IL-4、TGF-β水平降低（P＜0.05）。Th17/Treg比值升高與流式細胞分析結果相符，說明孕早期SH患者外周血中Th17/Treg失衡，Th17 細胞數量增多，導致其分泌的細胞因子IL-35 明顯增加，TGF-β1 卻明顯降低。Th17 和Treg細胞的分化均需要轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β），人Th17 細胞的分化受到高水平TGF-β的抑制，但需要IL-1 和IL-6的參與。當樹突狀細胞被誘導產生IL-6 或IL-1 被激活時，TGF-β誘導天然T細胞的分化從誘導Treg細胞途徑轉向Th17 細胞途徑[18]。本研究顯示，試驗組TGF-β水平低于對照組，IL-17 水平高于對照組（P＜0.05），可能是SH孕婦發生早產或先兆流產的原因之一。Treg細胞被認為是維持妊娠期免疫耐受性的主要貢獻者，在人類流產過程中，外周和蛻膜淋巴細胞中的Treg頻率降低，外周Treg細胞比率被認為是有受孕失敗史的孕婦流產風險的預測指標。先兆子癇中Treg細胞參與的3 個群體CD4+CD25高、CD4+CD127低CD25+和CD4+Foxp3+細胞的頻率均低于正常妊娠。研究[19]表明，患有復發性自然流產的婦女IL-35 水平較低，表明IL-35 可能參與妊娠的維持。此外，先兆子癇受試者血清IL-35 水平升高[20]。本研究發現，試驗組血清中IL-35水平高于對照組，可能原因為IL-35 不僅由Treg細胞分泌，也可由滋養層細胞分泌產生，以維持母胎耐受性[21]。

在患有復發性流產、反復種植失敗和自身免疫性疾病的女性中，外周血Th1/Th2 和Th17/Treg細胞比率與可育對照組相比均有提高[22-23]，與本研究結果類似。本研究試驗組外周血IFN-γ/IL-17 比值明顯高于對照組（P＜0.05），說明孕早期SH患者Th1 型免疫顯著增強，為避免反復流產、早產和先兆子癇，Th1 型免疫需受到控制。

綜上所述，外周血WBC、RBC、Hb、Neu%、Lym%可作為孕早期SH診斷的輔助指標。孕早期SH患者外周血中Th1/Th2、Th17/Treg、Th1/Th17 比值均升高，處于一定失衡狀態，故Th1/Th2、Th17/Treg、Th1/Th17可作為孕早期SH患者細胞免疫狀態是否改變的判斷指標，為臨床干預治療提供新靶點。Th1、Th2、Th17和Treg各細胞亞群之間的失衡在妊娠期SH的發生、發展、診斷和治療中具有重要意義。本研究不足之處為臨床樣本量較少，且分布具有一定局限性，后續將納入不同地區、人種的臨床樣本進行分析研究，為臨床孕早期SH孕婦的診斷和預后提供有力支持。