miR-23b-5p通過靶向下調FN1緩解支氣管哮喘氣道重塑

白詩瑤，包慧靜，馬琳，麻雪晴，李丹玲，蘇新明

（中國醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，沈陽 110001）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是以氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應性為主要病理改變的慢性氣道疾病，其中氣道重塑主要表現為各種結構改變所致的氣道壁增厚，包括氣道平滑肌細胞的炎癥、肥大和（或）增生，上皮下纖維化，杯狀細胞增生，膠原沉積以及血管增多等［1-2］。微RNA（microRNA，miRNA）是一種小分子非編碼RNA，通過與mRNA的3’非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）不完全結合，啟動靶基因mRNA降解程序并抑制其翻譯，在過敏性哮喘的發生、發展中起重要作用，被認為是過敏性哮喘的潛在生物標志物之一［3］。miR-23b可通過結合不同的靶基因，參與細胞的增殖、遷移和分化以及上皮-間質轉化等多種生物學過程［4-6］。研究［7］表明，miR-23b過表達能夠促進氣道平滑肌細胞的凋亡并抑制其增殖。本研究制備哮喘小鼠模型，檢測miR-23b在正常和哮喘小鼠肺組織中的表達差異，獲得miR-23b可能影響哮喘氣道重塑的靶基因，進一步探討miR-23b參與哮喘氣道重塑的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：雞卵白蛋白，購自美國Sigma公司；原代平滑肌細胞培養體系，購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司；Lipofectamine 2000，購自美國Invitrogen公司；miR-23b-5p模擬物（miR-23b-5p mimic）、抑制劑（miR-23b-5p inhibitor）及陰性對照（miR-NC），miRNA實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）引物、U6引物、反轉錄試劑盒，購自廣州銳博生物科技有限公司；纖維連接蛋白1（fibronectin1，FN1）兔源多克隆抗體，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔源單克隆抗體，購自美國Abcam公司；β-actin兔源單克隆抗體，購自美國CST公司；AG RNAex Pro RNA提取試劑、SYBR Green Pro Taq HS預混型qRT-PCR試劑盒，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Masson三色染色試劑盒和免疫組織化學顯色試劑盒，購自福州邁新生物技術開發有限公司；小鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA檢測試劑盒，購自美國R&D公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司。

1.1.2 實驗動物分組和模型制備：健康SPF級雌性BALB/c小鼠12只，6～8周齡，體質量（20±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。將12只小鼠隨機分為正常對照組和哮喘組，每組6只。于SPF級動物房適應性飼養1周后，哮喘組于第0、7、14天給予含Ⅴ級卵白蛋白（20 μg）和氫氧化鋁（2 mg）的卵白蛋白致敏液0.2 mL腹腔注射，于第21天應用壓縮空氣式霧化器霧化2% Ⅱ級卵白蛋白激發液，3次/周，30 min/次，連續8周。正常對照組致敏和激發均給予生理鹽水替代卵白蛋白。

1.1.3 細胞培養、轉染和分組：人支氣管平滑肌細胞（human bronchial smooth muscle cell，HBSMC）購自美國組織培養庫，接種在含10%胎牛血清、100 U/mL鏈霉素-青霉素的平滑肌細胞培養基中，置于37 ℃、含5%CO2的細胞培養箱中培養。按照Lipofectamine 2000說明書，將miR-NC（miR-NC組）、miR-23b-5p模擬物（miR-23b-5p mimic組）、miR-23b-5p抑制劑（miR-23b-5p inhibitor組）轉染HBSMC。

1.2 方法

1.2.1 肺組織病理染色：取各組小鼠左側肺組織，用4%多聚甲醛固定后，全自動脫水機脫水，石蠟包埋，制備切片，切片厚度4 μm，65 ℃烤箱中烘烤3 h后，室溫保存備用。切片脫蠟至水后，使用Masson三色染色試劑盒，根據說明書，應用Masson復合染液染5 min，蒸餾水洗去染液后滴加磷鉬酸，5 min后甩干。苯胺藍染1 min，蒸餾水稍洗，滴加分化液分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察氣道壁周圍膠原沉積水平，應用ImageJ軟件分析膠原沉著區占基底膜區面積的百分比。

1.2.2 血清細胞因子檢測：應用ELISA檢測血清中IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF水平。操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.3 qRT-PCR檢測肺組織miR-23b-5p表達水平：提取肺組織總RNA，按說明書配置反轉錄反應體系。反應條件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 10 min。使用梯度PCR儀進行反轉錄反應，獲得cDNA并分裝保存于-80 ℃冰箱內備用。SYBR Green Mix配置qRTPCR反應體系，使用Roche LightCycler 480 Ⅱ型qRTPCR儀進行兩步法qRT-PCR。反應結束后，檢測并確認擴增曲線和溶解曲線，記錄Ct值。以U6為對照，采用Livak法進行qRT-PCR相對定量分析。

1.2.4 SP法免疫組織化學染色：石蠟切片復溫后脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復緩沖液微波修復30 min，放涼至室溫后PBS洗3次，3 min/次。擦干切片上多余水分，應用免疫組織化學試劑盒，內源性過氧化物酶阻斷劑處理10 min，PBS沖洗；非特異性染色阻斷劑封閉30 min，甩干；一抗FN1、α-SMA（PBS稀釋，稀釋比為1 ∶1 000）4 ℃孵育過夜；過夜后室溫下復溫45 min，PBS洗去抗體，滴加辣根酶標記山羊抗兔/鼠二抗10 min，PBS沖洗；鏈霉親和素-過氧化酶復合物染10 min，PBS沖洗；滴加DAB顯色液后于顯微鏡下觀察顯色，自來水下沖洗10 min，蘇木素復染核5 min，流水振洗，鹽酸乙醇分化10 s，返藍10 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察FN1、α-SMA在肺組織中表達分布，ImageJ軟件半定量分析FN1、α-SMA平均光密度。

1.2.5 Western blotting：提取蛋白并使用BCA試劑盒定量后，加入上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱5 min使蛋白質變性，-80 ℃冰箱凍存備用。PAGE蛋白凝膠電泳（120 V，60 min），轉膜（0.25 A，90 min），快速封閉液室溫封閉30 min，FN1、α-SMA、β-actin以1 ∶1 000稀釋比稀釋后4 ℃孵育過夜，TBST洗去生物膜表面抗體后，辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L）以1 ∶5 000稀釋比稀釋后室溫孵育1 h，ECL法檢測蛋白表達，UVP系統成像，應用ImageJ軟件對所得蛋白條帶進行灰度值分析。

1.2.6 雙熒光素酶實驗檢測miR-23b-5p是否靶向FN1：通過TargetScan網站（https：//www.targetscan.org/vert_80/）預測miR-23-5p與FN1mRNA的3’-UTR存在結合位點。采用陽離子脂質體法轉染細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，檢測雙熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

應用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析。計量資料用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 哮喘小鼠肺組織病理改變

Masson染色結果顯示，哮喘組小鼠氣道壁周圍大量藍色膠原沉積，氣道平滑肌增厚、塌陷。與正常對照組相比，哮喘組小鼠氣道壁周圍膠原面積顯著增加（P＜ 0.001）。見圖1。

圖1 哮喘小鼠肺組織病理變化Fig.1 Pathological changes in the lung tissues of asthmatic mice

2.2 哮喘小鼠血清中炎性細胞因子水平變化

ELISA檢測結果顯示，與正常對照組相比，哮喘組小鼠血清中炎性細胞因子IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF表達水平顯著升高（P＜ 0.001）。見圖2。

圖2 哮喘小鼠血清中炎性細胞因子表達水平Fig.2 Levels of inflammatory cytokine in the serum of asthmatic mice

2.3 哮喘小鼠肺組織中miR-23b-5p表達降低

qRT-PCR結果表明，哮喘組與正常對照組小鼠肺組織中miR-23b-5p表達水平分別為0.000 4±0.000 12和0.001 0±0.000 27；與正常對照組相比，哮喘組小鼠肺組織中miR-23b-5p顯著下調（P＜ 0.05）。

2.4 哮喘小鼠肺組織中的FN1和α-SMA表達升高

免疫組織化學染色和Western blotting結果均顯示，正常對照組小鼠肺組織中可見FN1和α-SMA的表達，與正常對照組相比，哮喘組小鼠肺組織FN1和α-SMA表達顯著增加（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 哮喘小鼠肺組織中FN1和α-SMA表達水平Fig.3 Levels of FN1 and α-SMA expression in asthmatic mice

2.5 FN1是miR-23b-5p的直接靶點

TargetScan預測表明，FN1 3’-UTR是miR-23-5p靶向結合序列。雙熒光素酶檢測結果表明，與miRNC組及miR-23b-5p inhibitor組相比，miR-23b-5p mimic組野生型FN1熒光素酶活性強度顯著下調（P＜ 0.05），miR-23b-5p與FN1間存在靶向作用關系。見圖4。

圖4 哮喘小鼠肺組織中miR-23b-5p的靶向分析Fig.4 Targeting analysis of miR-23b-5p in asthmatic mice

2.6 miR-23b-5p抑制HBSMC中FN1的表達

與miR-NC組相比，miR-23b-5p mimic組HBSMC中FN1表達水平顯著下調（P＜ 0.05），而miR-23b-5p inhibitor組HBSMC中FN1表達水平顯著升高（P＜ 0.01）。見圖5。

圖5 HBSMC中FN1的表達水平Fig.5 Levels of FN1 in HBSMC

3 討論

氣道平滑肌層增厚是哮喘患者氣道壁重塑最顯著的病理表現之一，與哮喘嚴重程度密切相關［8］。研究［2］表明，大多數氣道重塑的特征表現會在一定程度上依賴炎癥，當發生氣道重塑時，氣道炎癥能夠進一步促進氣道過度狹窄，從而維持或增加氣道重塑水平，而氣道平滑肌的重塑改變也可以部分獨立于氣道炎癥。本研究通過制備哮喘小鼠模型，發現在長期的卵白蛋白刺激下，哮喘小鼠的氣道發生了明顯的重塑性改變，主要表現為氣道平滑肌增厚，氣道壁周圍膠原纖維沉積，血清中氣道重塑相關因子IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF的表達水平升高，這也與本課題組的前期研究［9］結果一致，表明哮喘小鼠模型構建成功。

miR-23b是由染色體9q22.32區域編碼的miR-23b/27b/24-1基因簇產生的一種多效性轉錄后調節因子，參與發育過程中正常的生長和分化、腫瘤、病毒感染、自身免疫性疾病等多種生物學過程和疾病的轉錄調節［10］。miR-23b在許多免疫過程中通過調節細胞因子（如IL-17、TNF-α）的表達，參與炎癥反應的反饋調控過程［3，10］，但其在哮喘氣道重塑中的作用及具體機制尚不明確。本研究結果表明，miR-23b-5p在哮喘小鼠肺組織中表達明顯下調。而miR-23b-5p也被認為是影響平滑肌細胞增殖的重要因素，是支氣管哮喘的潛在生物標志物和治療靶點［11］。miR-23b可通過結合不同的靶基因發揮其功能。本研究通過TargetScan預測到FN1可能是miR-23b-5p的靶基因，采用雙熒光素酶法進一步證實了FN1是miR-23b-5p的直接靶點。纖維連接蛋白是主要的細胞外基質蛋白，調控細胞的增殖、遷移等生物學行為。研究［12］發現FN1在哮喘患者的氣道中高表達，是過敏性哮喘氣道炎癥和氣道重塑的重要影響因素之一。本研究采用免疫組織化學染色和Western blotting半定量分析哮喘小鼠模型肺組織中FN1和α-SMA的表達水平，發現在哮喘發生時FN1和α-SMA表達升高，而過表達miR-23b-5p的氣道平滑肌細胞中FN1表達降低，說明miR-23b-5p可以通過靶向抑制FN1，從而在一定程度上抑制哮喘發生時的氣道重塑改變。

綜上所述，miR-23b-5p在哮喘小鼠肺組織中表達下調，上調miR-23b-5p的表達能夠抑制氣道平滑肌的重塑改變，其機制可能與 miR-23b-5p直接靶向抑制FN1的表達有關。但這一機制還有待進一步研究，以明確miR-23b-5p調控哮喘發生時氣道重塑的具體機制，從而為哮喘的治療提供新靶點。