靶向表皮生長因子受體的泛素化修飾

張夢，湯雋，張樹玲，趙健竹

（中國醫科大學附屬盛京醫院 1.腫瘤科；2.胸外科，沈陽 110004）

泛素是一類由76個氨基酸組成的高度保守的蛋白質，分子量約為8.5×103，廣泛存在于所有真核細胞中。泛素分子攜帶7個賴氨酸殘基（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），底物蛋白可以在一個或多個位點的賴氨酸殘基進行泛素化，底物蛋白結合的賴氨酸殘基不同，底物蛋白的去向不同。泛素化修飾是一個主要由泛素激活酶E1、泛素結合酶E2 和泛素連接酶E3等介導的多級酶聯反應。首先，E1 利用 ATP 提供的能量，在泛素 C 端賴氨酸殘基上的羧基基團與自身的半胱氨酸殘基上的巰基基團間形成高能硫酯鍵，從而活化泛素分子。然后，激活的泛素通過硫酯鍵被接合到 E2 的半胱氨酸殘基上。最終，激活的泛素或者通過E2直接連接到蛋白底物上，或是在E3作用下，通過泛素的羧基末端與靶蛋白賴氨酸殘基的氨基之間形成氨基異肽鍵，將泛素轉移到靶蛋白上。在這一系列酶促級聯反應中，E3在靶蛋白的特異性識別以及泛素化系統的調控中起最重要的作用。根據E3的特征結構域及泛素傳遞到靶蛋白的作用機制，E3被分為3個家族類型：含RING finger結構域的E3、含HECT結構域的E3以及含U-box結構域的E3［1-4］。泛素化參與體內各種蛋白質的降解和（或）信號通路的變化，調控機體的各種生理功能［5-6］。

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是由Erbb-1基因編碼的具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜受體，參與細胞增殖、有絲分裂等，在腫瘤發展、腫瘤靶向治療藥物耐藥中起重要作用。EGFR具有3個蛋白結構域，包括胞外配體結合結構域、疏水跨膜結構域和胞漿酪氨酸激酶結構域。EGFR通過結合各種細胞外表皮生長因子配體如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）而被激活，導致其形成二聚體，二聚體刺激受體固有的酪氨酸激酶活性，并觸發自磷酸化。隨后，受體傳遞細胞反應，介導各種細胞活動，包括細胞增殖、分化、存活和生長。EGFR基因擴增或突變、基因重排和不同剪接變異體的產生是EGFR參與腫瘤轉化或癌癥進展的重要途徑［7-11］。EGFR可以通過配體結合泛素化的方式，進行翻譯后修飾。目前發現有多種E3參與EGFR的泛素化修飾，直接參與EGFR蛋白降解、介導EGFR通路信號改變、增強EGFR蛋白穩定性等，泛素后的EGFR可經蛋白酶體途徑、網格蛋白介導的或非網格蛋白介導的內吞途徑降解［12］。

1 野生型EGFR蛋白的泛素化修飾

1.1 Casitas B家系淋巴瘤（Casitas B-lineage lymphoma，Cbl）家族為最早鑒定的泛素EGFR的E3

泛素連接酶Cbl家族成員（Cbl、Cbl-b和Cbl-c）是受體酪氨酸激酶的負性調節因子，Cbl家族蛋白依賴性泛素化在配體誘導溶酶體靶向和降解中發揮重要作用。其中，Cbl-c聯合表皮生長因子受體途徑底物15（epidermal growth factor receptor pathway substrate 15，EPS15）中功能性泛素相互作用基序來介導EGFR的內吞。Cbl-c結合于EPS15中功能性泛素相互作用基序，募集活化的EGFR進入含有EPS15的囊泡。泛素后的EGFR復合物作為EPS15的對接位點，將受體招募到網格蛋白的囊泡中。Cbl-c可以通過2種不同的機制引導泛素化的EGFR進入含有EPS15的內化路徑：一種為依賴直接與EGFR結合的Cbl-c的磷酸酪氨酸結合區域；另一種為依賴鋅指結構的C端，從而間接結合于受體。因此，Cbl-c介導EPS15參與活化后EGFR的內吞降解［13］。

1.2 具有RING finger結構域的生長調節劑1（cell growth regulator with RING finger domain 1，CGRRF1）在乳腺癌中調控EGFR泛素化

CGRRF1是一種生長抑制因子，由一個跨膜結構域和一個RING finger結構域組成。許多含有RING finger結構域的蛋白質具有E3的功能，可以將泛素從E2轉移到底物蛋白上。CGRRF1在體內和體外都能抑制乳腺癌的生長，敲除CGRRF1基因可促進乳腺癌細胞系的生長，過表達CGRRF1基因可以抑制乳腺癌細胞系的生長，RING finger結構域對其生長抑制活性至關重要。在異種移植實驗中，過表達CGRRF1基因的異種移植細胞中EGFR表達較低，相反，在CGRRF1基因敲除或敲低細胞中EGFR表達增強。CGRRF1通過K48鏈接的泛素化作用使EGFR泛素化，從而導致EGFR通過蛋白酶體降解［14］。

1.3 瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）在胰腺癌中調控EGFR泛素化

TRPV1首先在感覺神經元中被發現，它被認為是緩解疼痛的治療靶點。在胰腺癌細胞PANC-1中，過表達TRPV1基因后，EGFR表達降低，然而沉默TRPV1基因后，EGFR表達增加。TRPV1基因過表達抑制細胞增殖，顯著降低KRAS和AKT2兩種癌基因的mRNA水平。更重要的是，TRPV1通過誘導EGFR泛素化和降解來下調EGFR水平，從而調節胰腺癌細胞中EGFR/MAPK信號通路。這些結果揭示了TRPV1對胰腺癌細胞EGFR的調控作用及其機制，為設計新的靶向EGFR的抗胰腺癌藥物提供了新思路［15］。

1.4 包含HECT、UBA和WWE結構域的蛋白1（HECT，UBA，and WWE domain-containing protein 1，HUWE1）促進EGFR泛素化和降解

HUWE1是一個分子量約為482×103的E3，被認為具有腫瘤促進和（或）腫瘤抑制功能。TGF-β1是腎臟纖維化的關鍵介質，它抑制HK-2細胞中HUWE1表達，增加EGFR表達。HUWE1與EGFR相互作用，過表達HUWE1基因的HK-2細胞中，EGFR蛋白顯著降低，而EGFRmRNA未顯著降低，表明HUWE1對EGFR的下調發生在翻譯后水平。用MG132處理HK-2細胞以抑制蛋白質降解時，EGFR表達增加，這表明HUWE1對EGFR的調控與蛋白質降解泛素-蛋白酶體途徑之間存在聯系。HK-2細胞中，HUWE1基因過表達誘導EGFR蛋白的半衰期縮短。EGFR蛋白在HUWE1基因過表達的HK-2細胞中，偶聯的泛素量是載體控制細胞中的2倍多，這表明HUWE1是參與EGFR降解的E3［16］。

1.5 環指蛋白144A（RING finger protein 144A，RNF144A）促進EGFR泛素化并維持EGFR穩定

RNF144A是一種含RING finger結構域的E3，RNF144A包含1個RING finger結構域和1～2個跨膜結構域。在幾種類型癌癥中，RNF144A的表達與EGFRmRNA和蛋白水平呈正相關。EGFR的配體誘導RNF144A和EGFR相互作用。RNF144A在EGF刺激過程中促進EGFR泛素化，維持EGFR穩定性，延長EGF/EGFR信號轉導。通過多種方法消耗RNF144A，會導致EGFR表達和EGF/EGFR信號轉導的降低。RNF144A的消耗減少了依賴EGF的細胞增殖［17］。

1.6 Smad泛素化調節因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，SMURF2）促進EGFR泛素化并維持EGFR穩定

SMURF2是一種HECT型E3，SMURF2可以泛素化EGFR，但通過保護EGFR不受Cbl-c介導的降解而穩定EGFR。相反，小干擾RNA 介導的SMURF2基因敲除會使EGFR蛋白不穩定，誘導自噬反應，并降低表達EGFR的癌細胞的存活率，而對EGFR陰性癌細胞、正常成纖維細胞和正常上皮細胞的影響極小。頭頸部鱗狀癌細胞UMSCC74B在裸鼠體內形成侵襲性腫瘤，在小干擾RNA介導的SMURF2基因敲除后，其體內成瘤能力顯著喪失。EGFR和SMURF2mRNA和蛋白表達具有很強的相關性。這些結果表明，SMURF2介導的EGFR泛素化可能是某些腫瘤中EGFR高表達的原因，并支持靶向SMURF2-EGFR相互作用作為治療EGFR依賴性腫瘤的新治療方法［19］。

1.7 假性激酶Tribble 3（pseudokinase Tribble 3，TRIB3）招募含有WW結構域的E3泛素蛋白連接酶1（WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1）促進EGFR泛素化并維持EGFR穩定

TRIB3作為一種壓力傳感器，對各種壓力源做出反應，通過與信號轉導蛋白和功能蛋白相互作用，參與慢性炎癥、代謝和惡性疾病。TRIB3通過與自噬受體P62相互作用，破壞自噬體和蛋白酶體降解癌細胞中蛋白質的功能，從而促進幾種腫瘤的發生和發展。TRIB3缺失導致多種腫瘤促進因子（包括EGFR）表達顯著降低。TRIB3基因過表達增強K63鏈接的EGFR泛素化，并且修飾發生在EGFR的近膜區。TRIB3與EGFR相互作用，招募蛋白激酶C-α，使EGFR在T654位點磷酸化，導致WWP1催化K63鏈接的K689泛素化EGFR，增強EGFR的再循環，從而增強了EGFR的穩定性，促進腫瘤的進展［20］。

2 突變型EGFR蛋白的泛素化修飾

2.1 Hsc70相互作用蛋白的C端（C-terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP）促進突變的EGFR泛素化和降解

CHIP是一個HSP70/HSP90共伴侶，具有E3活性。CHIP自身的E3活性獨立于HSP70/HSP90。CHIP選擇性地與EGFR突變體（G719S、L747_E749del A750P和L858R）相互作用，降低其表達。CHIP的U-box結構域具有E3活性，是EGFR突變體通過泛素化下調所必需的。CHIP在肺腺癌細胞中選擇性相互作用，并下調內源性EGFR突變體。CHIP降低細胞增殖和致瘤性，尤其是在EGFR突變的非小細胞肺癌細胞系中。CHIP基因過表達抑制了EGFR突變株的細胞增殖和異種移植瘤的生長，但對野生型EGFR細胞株沒有抑制作用。EGFR突變體特異性泛素化修飾，可能是肺腺癌中EGFR調控的重要機制。CHIP可以有望成為克服EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）耐藥的新的治療靶點［21］。

2.2 姜黃素促進EGFR泛素化和降解

姜黃素是一種名為二氟乙烯基甲烷的天然化合物，可以通過多種機制抑制細胞周期進程、誘導細胞凋亡和抗轉移。姜黃素還通過調節EGFR蛋白水平下調前列腺癌細胞中的EGFR信號，表明姜黃素抑制內在的EGFR酪氨酸激酶活性，抑制配體誘導的EGFR激活。姜黃素能通過泛素化野生型EGFR和突變型EGFR（T790M細胞），誘導EGFR蛋白降解。姜黃素誘導的EGFR降解，可能通過增強吉非替尼耐藥細胞的泛素-蛋白酶體能力來實現［22］。

2.3 SMURF2促進突變的EGFR泛素化并維持突變的EGFR穩定

SMURF2與EGFR相互作用，對EGFR的穩定性和TKI的反應至關重要。L858R/T790M突變的EGFR優先被SMURF2-UBCH5（一種E3-E2介導的多聚泛素化）穩定。4個賴氨酸殘基作為泛素化位點，用擬乙酰化的谷氨酰胺取代其中一個殘基，會增加突變體EGFR對厄洛替尼誘導的降解敏感性。在肺癌細胞株中，SMURF2基因過表達增加了L858R/T790M突變的EGFR蛋白水平，增加了TKI耐受性，而SMURF2基因敲低可降低L858R/T790M 突變的EGFR蛋白水平，使肺癌細胞對TKI敏感。總體來說，SMURF2介導的L858R/T790M突變的EGFR多聚泛素化可能與乙酰化介導的受體內化相競爭，而后者與增強受體穩定性相關。因此，SMURF2增強L858R/T790M 突變的EGFR蛋白的穩定性和對TKI的抗性［23］。

3 展望

泛素對蛋白質的共價修飾在維持蛋白穩態、參與蛋白定位和轉位、調控蛋白活性和蛋白相關作用等方面扮演重要角色，使細胞對外部和內部刺激變化做出迅速、敏感的反應。蛋白質泛素化修飾廣泛參與細胞周期、細胞凋亡、轉錄因子調控、細胞內吞等病理生理過程，為更好地認知蛋白質的功能提供更寬泛的視角。EGFR的泛素化修飾被認為與EGFR的膜定位、降解、活化和內吞等過程密切相關。一般認為EGFR的泛素化為多位點的單泛素化，其泛素化形式包括以K48鏈為主和以K63鏈為主的2種不同形式。其中，K48鏈泛素化易被26S蛋白酶體識別和降解，而K63鏈泛素化則可被內吞體分選轉運復合體識別，誘導EGFR通過細胞內吞作用轉運至內涵體，并進一步通過溶酶體降解［24-25］。這一過程在下調EGFR相關通路及信號轉導、負性調控酪氨酸酶等過程中發揮至關重要的作用。Cbl家族是既往研究最為廣泛的泛素EGFR的E3。除此之外，近年來越來越多的證據表明，仍有部分E3參與EGFR泛素化過程，系統梳理其種類和功能，從而為進一步尋找新的臨床靶點提供基礎依據。EGFR及其下游通路的異常活化是泛素化中廣泛存在的驅動因素，目前針對EGFR的抑制劑已被廣泛用于臨床，如針對非小細胞肺癌中EGFR通路的TKI，已被臨床指南推薦作為EGFR敏感突變的一線治療首選。然而，目前第3代TKI奧西替尼在臨床治療中的主要瓶頸為治療后耐藥，其耐藥形式主要以EGFR通路依賴的突變為主，如20外顯子的C797S突變、20外顯子插入突變、18外顯子G724S突變以及EGFR擴增等［26］。因此，從泛素化蛋白降解的角度下調EGFR水平，成為扭轉耐藥的關鍵。

近年來被廣泛關注的蛋白水解靶向嵌合體（proteolysis targeting chimera，PROTACT）人工合成異源嵌合型分子，是針對EGFR TKI耐藥后治療策略的研究熱點。PROTACT技術是以招募靶蛋白相關E3為基礎，靶向識別目的蛋白，并通過泛素化降解靶蛋白的方法。目前，針對不同突變類型的EGFR蛋白的PROTACT分子研發正在開展廣泛的基礎研究，并已獲得初步研究結果［27］。因此，加強對EGFR E3的理解和分析，能夠促進尋找靶向泛素-蛋白酶體系統治療新靶點，為拓寬基礎研究和臨床策略提供多角度的理解和思路。