Trop-2基因在膀胱尿路上皮癌中的遺傳表達和臨床意義

付婷婷，林逸飛，廖邦華，楊勇，陳正龍，劉悅丹，黃進

（四川大學華西醫院 1.泌尿外科；2.醫療器械監管研究與評價中心；3.疾病分子網絡前沿科學中心，成都 610041）

膀胱癌是常見的男性泌尿生殖系統惡性腫瘤［1］。國際癌癥研究機構2020年全球數據顯示，膀胱癌新發病例數為573 278例/年，居全球男性惡性腫瘤的第6位。膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）是膀胱癌的主要類型［2］，具有局部浸潤轉移、易進展和復發等特點。其治療多以手術結合放化療為主，然而傳統化療方式容易產生較強的不良反應［3］。近年來，隨著腫瘤免疫學、腫瘤分子生物學、生物信息學等學科的迅速發展，針對腫瘤的基因診斷、基因治療、靶向治療已逐漸成為可能，這為膀胱癌的治療提供了更加廣闊的前景。腫瘤微環境中的免疫浸潤物也在腫瘤的發生、發展以及患者結局中起關鍵作用。因此，腫瘤浸潤免疫細胞的全面分析將闡明癌癥免疫逃逸的機制，進而為開發新的治療策略提供機會［4］。

人滋養細胞表面糖蛋白抗原2（trophoblast cellsurface antigen 2，Trop-2）是由染色體1P32區域TACSTD2基因編碼表達的細胞表面糖蛋白。已有研究［5］發現，Trop-2基因高表達于多種腫瘤，如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、結腸癌和膀胱癌，可促進腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移、擴散等過程的發生。同時，其高表達往往與腫瘤患者的不良預后密切相關［6］。近期，針對乳腺癌的靶向Trop-2的抗體偶聯藥物［7］已獲得批準，成為首個Trop-2上市藥物。目前，Trop-2已成為開發腫瘤抗體偶聯藥物的新靶點，且已有部分新的抗體偶聯藥物是針對膀胱癌的，但Trop-2在膀胱癌發生、發展過程中的具體機制尚未明確。

本研究基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫的信息，通過分析Trop-2在BLCA中的表達特點，尋找誘發該基因在BLCA中高表達的機制，發現Trop-2相關信號通路；通過cBioPortal工具找到BLCA中與Trop-2共表達基因，通過TIMER工具研究Trop-2表達與BLCA中免疫細胞浸潤的關系；探討Trop-2對BLCA預后的影響，為進一步明確BLCA的發病機制和治療策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從UCSC Xena［8］（https：//xena.ucsc.edu/）下載TCGABLCA的RNA-seq數據和生存數據，提取Trop-2基因表達信息，提取年齡、性別、TNM分期、病理分期以及腫瘤的組織學分級等臨床信息，最終納入426例BLCA樣本。在人類蛋白質圖譜數據庫（Human Protein Atlas，HPA）中檢索“TACSTD2”，選擇“Tissue”和“Pathology”選項卡，獲取Trop-2在正常膀胱組織和BLCA組織中的免疫組織化學染色圖像資料。共獲得5例正常膀胱組織和23例BLCA組織的免疫組織化學染色圖像資料。

1.2 生物信息學分析工具

本研究利用R語言、GEPIA2、UALCAN、TIMER、cBioPortal、HPA等在線工具對Trop-2基因進行生物信息學分析。

1.3 Trop-2表達與富集分析

利用GEPIA2工具比較Trop-2在癌組織和正常組織中的表達差異，通過HPA數據庫比較Trop-2在正常膀胱組織與BLCA組織中蛋白表達的差異，利用cBioPortal工具從表觀遺傳層面分析Trop-2異常表達的原因。基于TCGA-BLCA樣本數據，利用R語言對差異基因進行富集分析，用BH法校正P值，以校正P＜ 0.05、|log2FC|＞1為標準篩選出差異基因，提取上調基因，對其進行富集，分析影響腫瘤發生的潛在途徑。

1.4 Trop-2共表達基因分析和腫瘤免疫浸潤分析

利用cBioPortal工具進行數據挖掘，篩選與BLCATrop-2正向共表達的基因，以FDR≤1.0E-20為標準，按Spearman相關系數r由高到低選擇與Trop-2相關的顯著基因，再利用TIMER工具驗證Trop-2與這些基因的相關性。利用TIMER工具分析Trop-2及其共表達基因與BLCA中免疫細胞浸潤的關系，r表示相關性，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

1.5 Trop-2對BLCA預后影響的分析

基于TCGA-BLCA的RNA-seq數據，利用R語言提取Trop-2在不同樣本中的表達量，按照中位數分為高表達和低表達，進行生存分析，比較高表達人群與低表達人群的風險比（hazard ratio，HR），P＜ 0.05為差異有統計學意義。按照腫瘤的TNM分期和腫瘤組織學分級進行亞組生存分析，按照中位數分為高表達和低表達（由于腫瘤Ⅰ期的樣本太少，僅對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期進行分析；由于腫瘤組織學低級樣本太少，僅對高級樣本進行分析），分析步驟同上。

2 結果

2.1 Trop-2在BLCA中的表達情況

本研究使用GEPIA2在線工具評估了Trop-2在泛癌中的表達水平，發現其在大多數癌癥中呈高表達狀態，包括BLCA（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 Trop-2基因在泛癌中表達情況Fig.1 Trop-2 expression in pancarcinoma

HPA數據庫包含Trop-2在5例正常膀胱組織樣本和23例BLCA組織樣本中的免疫組織化學染色結果（抗體HPA043104、HPA055067、CAB072852）。與正常膀胱組織相比，BLCA組織中Trop-2蛋白表達（棕黃色顆粒）數量和深度均明顯高于正常膀胱組織。由此可見，Trop-2蛋白在BLCA組織中的表達顯著高于正常膀胱組織。見圖2。

圖2 Trop-2免疫組織化學染色結果Fig.2 Immunohistochemical staining result of Trop-2

2.2 Trop-2的 DNA甲基化水平

利用cBioPortal數據庫進行DNA甲基化狀態與Trop-2表達的相關性分析，明確表觀遺傳因素對調控Trop-2基因表達的作用。結果發現，泛腫瘤中DNA甲基化與Trop-2表達呈負相關（P＜ 0.05），尤其在BLCA（r=-0.38，P=1.40E-5）、前列腺癌（r=-0.40，P=3.48E-20）、乳腺浸潤癌（r=-0.49，P=9.39E-42）等腫瘤中呈顯著負相關。使用UALCAN數據庫進一步驗證Trop-2啟動子DNA甲基化狀態的差異，結果發現，在BLCA、前列腺癌、浸潤性乳腺癌等腫瘤中，癌組織中Trop-2甲基化比癌旁組織少，符合上述分析結果。見圖3。

圖3 DNA甲基化狀態與Trop-2表達的關系Fig.3 Relationship between DNA methylation status and Trop-2 expression

2.3 Trop-2富集分析

對篩選出的1 634個高表達差異基因進行富集，結果顯示，KEGG富集共19條顯著通路，GO富集共279個生物學過程、69個分子生物學功能、88個細胞組分。研究發現，上調基因通過DNA結合（FDR=2.40E-8）、細胞分裂（FDR=2.90E-20）、細胞周期（FDR=5.50E-12）、病毒致癌作用（FDR=4.90E-6）、p53信號通路（FDR=3.70E-3）等過程影響BLCA的發生。見圖4。

圖4 Trop-2高表達組織樣本富集分析結果Fig.4 Enrichment analysis of tissue samples with high expression of Trop-2

2.4 BLCA中Trop-2共表達基因分析和腫瘤免疫浸潤分析

共有57個顯著正相關基因，其中MUC20（r=0.59，FDR=1.94E-34）、RHBDL2（r=0.58，FDR=4.48E-34）、SPINT1（r=0.57，FDR=9.19E-33）、GJA9（r=0.57，FDR=1.03E-31）與Trop-2顯著正相關。見圖5。

圖5 BLCA中與Trop-2正相關的基因Fig.5 Genes positively correlated with Trop-2 in BLCA

腫瘤的發生、發展與腫瘤微環境中免疫細胞浸潤、免疫修飾和免疫逃避密切相關。結果顯示，Trop-2的表達水平與B細胞浸潤程度呈顯著正相關（r=0.13，P=0.01），與輔助性T細胞（CD4+T細胞）呈負相關（r=-0.12，P=0.03）。與Trop-2表達正相關的7個最顯著基因（FDR＜1.0E-30）是MUC20、RHBDL2、SPINT1、GJA9、EPS8L1、ADGRF1和C1ORF116。分析這些共表達基因與浸潤免疫細胞之間的關系，結果發現，MUC20（r=0.21，P=4.17E-5）、RHBDL2（r=0.22，P=3.59E-5）、GJA9（r=0.21，P=8.38E-5）與B細胞最顯著相關；MUC20（r=0.18，P=6.56E-4）、SPINT1（r=0.16，P=2.53E-3）與巨細胞最顯著相關；SPINT1（r=-0.20，P=1.82E-4）與CD4+T細胞最顯著相關；MUC20（r=-0.15，P=3.16E-3）、EPS8L1（r=-0.18，P=6.15E-4）與細胞毒性T細胞（CD8+T細胞）最顯著相關。

2.5 Trop-2在BLCA中的預后分析

按Trop-2基因表達量的中位數繪制的疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）具有邊際顯著效應（HR=0.74，95%CI：0.52～1.05，P=0.09）。腫瘤組織學高級，病理分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期亞組的DSS無顯著差異。見圖6。

圖6 Trop-2基因對BLCA預后的影響Fig.6 Effect of Trop-2 gene on prognosis of BLCA

3 討論

本研究應用生物信息學方法，發現Trop-2在BLCA中過表達，并與DNA甲基化呈顯著負相關。通過富集分析，確認了DNA結合、細胞分裂、細胞周期、病毒致癌作用、p53信號通路等過程可能是Trop-2在BLCA中產生生物學行為的最顯著途徑。通過分析Trop-2及共表達基因與BLCA浸潤免疫細胞的關系，發現Trop-2及多數共表達基因的表達與B細胞和巨噬細胞呈顯著正相關，與CD4+T細胞和CD8+T細胞呈負相關，一定程度上說明了免疫過程在腫瘤發生中的作用。

2017年NERI等［9］首次證實，DNA突變和甲基化缺失是導致癌癥的一個重要原因，正常表觀遺傳機制的破壞即DNA甲基化，是已知的癌癥發生的早期事件。Trop-2是一種與惡性腫瘤發生、侵襲和轉移有關的癌基因，本研究發現其表觀遺傳變化在調控BLCA發育和免疫耐受中發揮重要作用。BLCA中Trop-2的表達與DNA甲基化存在顯著負相關，提示Trop-2基因表達量異常升高可能是DNA甲基化水平降低的結果，通過檢測Trop-2相關的DNA甲基化水平，可以早期診斷和評估BLCA。此外，在遺傳層面，Trop-2的表達與DNA結合、細胞周期、病毒致癌作用、p53信號通路等生物過程相關，具有促進腫瘤細胞生長、增殖和轉移的潛在作用。

腫瘤的發生是多因素、多階段、多基因相互作用的，僅研究單基因對膀胱癌的影響是片面的。因此，探索Trop-2及其共表達基因在膀胱癌發生、發展中的作用具有非常重要的意義。本研究利用在線工具篩選出57個正向共表達基因，其中MUC20、RHBDL2、SPINT1、GJA9、EPS8L1、ADGRF1和C1ORF116等與Trop-2呈明顯的共表達。同時，通過腫瘤免疫浸潤分析發現，Trop-2及共表達基因與B細胞呈顯著正相關，而與T細胞呈顯著負相關。B細胞在一定條件下可以抵御腫瘤，主要是通過產生腫瘤特異性抗體和呈遞腫瘤抗原，但某些B細胞亞群也可以抑制抗腫瘤免疫、促進腫瘤生長。2021年研究［10］首次發現B細胞會分泌神經遞質γ-氨基丁酸，進而抑制細胞毒性T細胞功能，促進腫瘤相關巨噬細胞分化，抑制抗腫瘤免疫。結合本研究的生物信息學分析結果，推測Trop-2及共表達基因可能通過B細胞抑制T細胞功能、促進腫瘤相關巨噬細胞分化，抑制抗腫瘤免疫。

已有研究［11］表明，Trop-2基因高表達在多種癌癥中具有不良預后，土耳其大學醫學院研究團隊回顧性分析了2013至2018年間行前列腺癌根治性切除術的101例患者的組織病理學特征，發現Trop-2在前列腺癌中表達較高且與不良預后相關，此類現象還在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤中出現。然而，本研究未能發現基于TCGA-BLCA的Trop-2表達與BLCA的生存資料有顯著差異。Trop-2作為癌癥驅動因子，調控BLCA發生的分子機制和組織病理通路十分復雜，針對不同種類的癌癥，甚至同種類型的癌癥，導致癌癥發生的結果和預后不盡相同。因此，未來需要更大、更全面的樣本，更深入地去探索Trop-2基因在BLCA預后中的臨床意義。

Trop-2在多種實體腫瘤中高表達，已經逐漸成為開發抗體偶聯藥物的主要靶點。本研究同樣發現了ERBB2（酪氨酸激酶受體編碼基因，又名HER2）與Nectin-4在BCLA中為共表達基因。HER2基因變異廣泛存在于許多實體腫瘤中，包括乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、頭頸腫瘤等。目前，美國食品藥品監督管理局已經批準曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、拉帕替尼、來那替尼、T-DM1用于HER2陽性乳腺癌［12］的治療，HER1/HER2雙靶向抑制劑阿法替尼、達克替尼用于HER1敏感突變的非小細胞肺癌治療等［13］。此外，Nectin-4作為抗體偶聯藥物的潛力靶點，已于2019年12月獲得美國食品藥品監督管理局加速批準，用于治療接受PD-1/PD-L1抑制劑治療期間或治療后病情進展的局部晚期或轉移性BLCA患者［14］。近來，Trop-2抗體偶聯藥物也迎來了多次重大進展，其中sacituzumab govitecan-hziy已經獲得批準上市［15］。目前，以Trop-2為靶點的抗體偶聯藥物藥物已逐步開始用于治療膀胱癌的臨床試驗，其具體療效與安全性有待臨床研究證實。

盡管本研究從多角度論證了Trop-2基因在BLCA中具有重要意義，但本研究存在一些局限性：缺乏相關的實驗驗證，且僅利用公開數據庫進行研究，缺乏亞裔人群，仍需要更大的樣本量進行進一步驗證。

綜上所述，本研究基于生物信息學數據庫的挖掘，發現Trop-2表達在BLCA組織中呈上調趨勢，可能作為潛在的癌基因參與BLCA的發生、發展過程，通過參與細胞周期、病毒致癌作用、p53信號通路等生物過程調控BLCA的進展。同時，Trop-2及其多數共表達基因與B細胞和巨噬細胞呈顯著正相關，與CD4+T細胞和CD8+T細胞呈負相關，提示Trop-2可能通過上調B細胞來抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞，從而實現免疫逃逸。Trop-2作為良好的抗體偶聯靶點，具有精準治療的特性，針對Trop-2基因的抗體偶聯藥物臨床運用的前景值得期待。