急性馬兜鈴酸中毒小鼠腎損傷及Wnt7b/β-catenin/MMP-7的表達變化

王一凡，劉爽，汪思齊，李茂娟，黃春華，樓迪棟

（1.貴州中醫藥大學基礎醫學院法醫學教研室/貴州中醫藥大學司法鑒定所，貴陽 550000；2.貴州省法醫中藥毒理學特色重點實驗室，貴陽550000）

馬兜鈴酸（aristolochic acids，AA）是馬兜鈴科中藥材的主要毒性成分，能引起腎損傷和纖維化［1］。其中AAⅠ的毒性最大［2］，攝入含有AA的中草藥引起的急性或慢性腎小管間質疾病被稱為AA腎病（aristolochic acid nephropathy，AAN）［3-5］。臨床上對含有AA中草藥的使用有嚴格的規范，但相關中毒事件仍有發生［6］，如未及時治療會發展為慢性腎功能衰竭，最終形成終末期腎病［7］。

Wnt通路在機體發育、損傷修復過程中發揮著重要作用［8］。研究表明，Wnt7b能夠促進腎臟發育過程中腎小管的增殖分化［9］，參與斑馬魚腎臟損傷后的再生修復［10］，但Wnt7b在哺乳動物致腎臟損害發展過程中的作用機制仍缺乏基礎研究。本研究通過連續觀察急性AAN不同時期和部位的腎臟病理改變及Wnt7b相關蛋白的表達變化，探討急性AAN過程中的組織病理特征和Wnt7b通路作用機制，為明確AA的毒理機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

AAⅠ標準品（純度96%，四川省維克奇生物科技有限公司），溶于二甲基亞砜（北京索萊寶科技有限公司）與0.4%羧甲基纖維素鈉（上海展云化工有限公司）中，制成2 mg/mL AAⅠ懸濁液。HE染色液（北京索萊寶科技有限公司），免疫組化（immunohistochemistry，IHC）SP試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），Wnt7b兔多克隆抗體（賽默飛世爾科技中國有限公司），β-catenin鼠多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司），基質金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）兔多克隆抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物

雄性KM小鼠（長沙市天勤生物技術公司）113只，8周齡，質量（32±5）g，于貴州中醫藥大學實驗動物中心飼養，常溫環境，自由攝食、飲水。實驗過程嚴格按照《實驗動物福利倫理審查指南（GB/T358922018）》要求執行。

1.3 動物分組及給藥

將113只KM小鼠于籠中適應性喂養3 d，自由進食進水。

1.3.1 生存曲線給藥方式：將75只小鼠隨機分為5組（n=15），每組小鼠分別灌胃給藥AAⅠ20 mg/（kg·d）、15 mg/（kg·d）、10 mg/（kg·d）、5 mg/（kg·d）及0 mg/（kg·d）（溶劑對照）。

1.3.2 急性AAⅠ中毒模型給藥方式：將48只小鼠隨機分為2組（n=24），溶劑對照組小鼠灌胃給藥AAⅠ 0 mg/（kg·2 d），模型組小鼠灌胃給藥AAⅠ 5 mg/（kg·2 d）。

1.4 樣本采集

用藥后，對照組和模型組的小鼠各隨機取6只分別于第2、4、6和8 天戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，頸椎脫臼處死，摘眼球取血后，用PBS和固定液全身灌注，取雙側腎組織樣本，沿矢狀面分為2份，PBS沖洗，一份浸入4%多聚甲醛固定，另一份用2.5%戊二醛固定。

1.5 腎功能檢測

將采集的血液標本1 200 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，用mindray生化免疫流水線檢測其血肌酐和尿素氮含量。

1.6 組織病理學染色

將4%多聚甲醛固定的腎臟組織經乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋后切片（切片厚度2～4 μm），進行HE染色與Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化，并對腎小管損害指標等計數統計。

1.7 IHC染色

切片樣本放置于60 ℃烘箱中融蠟2 h，二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水。PBS沖洗后，置于100 ℃的檸檬酸緩沖液（pH6）中，微波爐高火加熱20 min，PBS浸洗。隨后滴加內源性過氧化物阻斷酶室溫孵育，PBS浸洗。分別加入Wnt7b（1∶200）、β-catenin（1∶200）和MMP-7（1∶100）3種蛋白的一抗，4 ℃冰箱孵育過夜，結束后用PBS浸洗。滴加生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗，滴加辣根酶標記鏈霉素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗。滴加DAB顯色液，PBS浸洗終止染色，蘇木素復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片。用ImageJ軟件對IHC圖像進行分析統計。

1.8 免疫電鏡

將組織從2.5%戊二醛固定后取出，乙醇梯度脫水，樹脂滲透后進行包埋。超薄切片機切成70～80 nm超薄切片，超純水懸浮 5 min，進行復溫后TBS清洗，用1%BSA 封閉液室溫封閉 30 min，加入Wnt7b（1∶200）和 β-catenin（1∶200）4 ℃過夜孵育，TBS清洗，加入4 nm膠體金羊抗鼠抗體（抗β-catenin）和12 nm膠體金羊抗兔抗體（抗Wnt7b），37 ℃烘箱孵育1 h，TBS清洗。鈾復染后用70%乙醇清洗，濾紙吸干后放入網板中，透射電子顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.9 統計學分析

Masson染色和IHC的圖像參考DESHPANDE 等［11］的方法，采用ImageJ軟件對光密度平均值進行統計，用隨機區域計數法對HE圖像和IHC圖像計數統計。采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，數據均以±s表示，多組間統計學差異（方差齊性檢驗后）采用單因素方差分析比較。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AAⅠ與小鼠生存曲線

將小鼠暴露于不同濃度的AAⅠ中，AAⅠ的濃度與小鼠生存時間呈負相關。當小鼠灌胃的AAⅠ濃度為20 mg/（kg·d）時，小鼠表現出急性毒性效應，5～8 d出現高死亡率。當AAⅠ濃度降至10 mg/（kg·d）時，小鼠的死亡率稍降低，當AAⅠ的濃度降至5 mg/（kg·d）時，小鼠生存率顯著上升；3組生存曲線與對照組相比有統計學差異（P均＜0.05），見圖1。

圖2 HE和Masson染色代表性圖像 × 20 Fig.2 Representative images stained by HE and Masson × 20

2.2 小鼠腎臟生化指標

血清肌酐和尿素氮檢測結果顯示，模型組血清肌酐在小鼠暴露于AAⅠ 6～8 d時出現顯著上升，8 d時為對照組的25倍，尿素氮也隨著小鼠暴露于AAⅠ的時間增加，8 d時出現統計學差異（P＜ 0.05）。見表1。

表1 小鼠血清肌酐和尿素氮（±s，n=3）Tab.1 Serum creatinine and urea nitrogen levels in mice（±s，n=3）

表1 小鼠血清肌酐和尿素氮（±s，n=3）Tab.1 Serum creatinine and urea nitrogen levels in mice（±s，n=3）

1）P ＜ 0.05 vs control group.

2.3 小鼠腎臟組織病理學

HE染色結果顯示，小鼠腎小管損傷程度隨著AAⅠ暴露時間增加而加重，腎小球無明顯改變；暴露于AAⅠ 2 d后，50%以上近端小管（proximal convoluted tubule，PCT）刷狀緣破壞，伴部分上皮細胞水腫，空泡樣變性；4 d時85%以上的PCTEC水腫，并出現少量壞死；6 d時壞死的PCT上皮細胞（proximal convoluted tubule epithelial cells，PCTEC）逐漸從基底膜脫落；8 d時PCTEC壞死脫落增加，腎小管出現大量基底膜裸露，管型數量增加（P＜ 0.05）。皮髓交界（corticomedullary-junction，CMJ）在暴露于AAⅠ 6～8 d時出現大量管型，遠曲小管（distal convoluted tubule，DCT）和集合管（collecting tubule，CT）在8 d時出現少量水腫。Masson染色結果顯示，AAⅠ暴露8 d后，腎皮質膠原容積分數（collagen volume fraction，CVF）較對照組顯著上升，有統計學差異（P＜ 0.01）。見圖 2、表2。

表2 腎小管損傷程度及Masson染色膠原容積分數（±s，n=3）Tab.2 Extent of renal tubular injury and collagen volume fraction determined by Masson staining（±s，n=3）

表2 腎小管損傷程度及Masson染色膠原容積分數（±s，n=3）Tab.2 Extent of renal tubular injury and collagen volume fraction determined by Masson staining（±s，n=3）

1）P ＜ 0.01 vs control group.

2.4 小鼠腎臟Wnt7b、β-catenin和MMP-7 IHC結果

Wnt7b的IHC結果顯示，模型組Wnt7b表達量上升，8 d時達到最高（主要聚集于刷狀緣）；暴露于AAⅠ8 d時，PCT、CMJ和CT處的Wnt7b的IHC平均光密度值增高，PCT的表達量增高至2 d時的2.5倍（P均＜0.05）；Wnt7b陽性的PCT比例增加，6～8 d時Wnt7b陽性小管數為70%（P均＜0.05）。見圖3、表3。

表3 Wnt7b免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.3 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with Wnt7b（±s，n=5）

表3 Wnt7b免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.3 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with Wnt7b（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

圖3 3種蛋白近端小管免疫組化染色代表性圖像 × 20Fig.3 Representative images of immunohistochemical staining of three proteins in the proximal convoluted tubules × 20

β-catenin的IHC結果顯示，模型組β-catenin表達量上升（PCT的近基底膜側）；第8天PCT、CMJ和CT處β-catenin的IHC平均光密度值和陽性小管與對照組相比明顯增加，有統計學差異（P＜ 0.05）。見圖3、表4。

表4 β-catenin免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.4 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with β-catenin（±s，n=5）

表4 β-catenin免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.4 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with β-catenin（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

MMP7的IHC結果顯示，模型組MMP7在胞質內表達量上升；PCT、CMJ和CT處MMP7的IHC平均光密度值和陽性腎小管與對照組相比明顯增加，有統計學差異（P＜ 0.05）。見圖3、表5。

表5 MMP-7免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.5 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with MMP-7（±s，n=5）

表5 MMP-7免疫組化平均光密度值及陽性腎小管比例（±s，n=5）Tab.5 Proportions of positive PCT cells and mean optical density of tissues stained with MMP-7（±s，n=5）

1）P ＜ 0.01 vs control group；2）P ＜ 0.01 vs 2 d.

2.5 小鼠腎臟Wnt7b和MMP7免疫電鏡結果

免疫電鏡結果顯示，對照組的PCTEC刷狀緣絨毛排列整齊，線粒體嵴清晰，數量較多；暴露于AAⅠ 2 d后PCTEC刷狀緣排列紊亂，線粒體數量減少；6 d時PCTEC空泡變性，刷狀緣絨毛大量脫落，線粒體數量明顯減少，呈“C”或“U”形。對照組未見Wnt7b膠體金顆粒，β-catenin膠體金顆粒主要聚集在細胞膜下；暴露于AAⅠ后，刷狀緣出現成簇聚集的Wnt7b膠體金顆粒，β-catenin膠體金顆粒在細胞膜下逐漸減少，核內聚集增加。見圖4。

圖4 Wnt7b和β-catenin免疫電鏡代表性圖像Fig.4 Representative immunoelectron microscopy images of Wnt7b and β-catenin proteins

3 討論

AA致腎損傷事件在非洲、亞洲和歐洲均有發生［12］，而且大量不明原因慢性腎臟病被疑與含有AA的中草藥有關［13］。因此，明確急性AAN早期的病理變化，闡明AAN的致病機制，對AAN的診斷和治療有重要價值。

急性AAN的病理改變表現為腎小管受損，主要累及PCT［4］，本研究連續觀察了AAN的腎小管病理學改變，結果顯示，AAN以PCT損害為主，且PCTEC的損傷呈時間和AAⅠ濃度依賴性；暴露于AAⅠ后，PCTEC刷狀緣絨毛脫落，線粒體形態異常，數量減少，細胞水腫、壞死、脫落。急性AAN的腎臟間質CVF增加，細胞外基質紊亂，膠原纖維增多，呈纖維化改變［14］。DCT和CT的病理改變時間較晚，以細胞水腫為主，AAⅠ主要通過分布于PCT的陰離子選擇通道蛋白進入細胞［15］。

目前研究［9］已經證明Wnt4和Wnt11參與腎纖維化過程，但Wnt信號通路在急性AAN過程中的機制并不清楚。巨噬細胞所分泌的Wnt7b在組織損傷誘導的炎癥過程中，參與腎小管損傷后的的修復與再生［16-19］。Wnt通路激活后β-catenin在胞質聚集并轉移到核內，激活下游基因表達（如參與細胞增殖和遷移的MMP-7）［20-21］。本研究結果顯示，AAⅠ可誘導Wnt7b在PCTEC的刷狀緣表達，β-catenin從膜下向胞質和細胞核內聚集，核內的表達量增高，MMP-7暴露于AAⅠ后表達量也逐漸升高。在6～8 d 時PCTEC大量壞死，壞死細胞中表達的Wnt7b、β-catenin和MMP-7會隨著細胞碎片在腎小管內聚集，使CMJ和CT處的蛋白表達增高，可能參與誘導啟動腎祖細胞的增殖修復過程［22］。本研究結果顯示，AAⅠ能夠激活Wnt/β-catenin信號，可能參與腎小管上皮細胞損傷后的再生與修復過程。

急性AAⅠ中毒小鼠的腎臟損害，主要以PCT上皮壞死和脫落為主，與時間和AAⅠ濃度呈正相關；DCT和CT損傷較輕，以水腫為主；PCTEC的Wnt7b、β-catenin和MMP-7的表達量增高，可能參與腎小管上皮細胞的修復和再生過程。