絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶11在泛癌的發生和預后中的作用及免疫分析

凌永嫦，李妹燕，仇雯麗，廖陸生，董明右，王俊利

（右江民族醫學院 1.附屬醫院產科；2.檢驗學院，廣西 百色 533000）

世界衛生組織2018年報告全球新發腫瘤約180萬例，死亡約950萬例，目前對于絕大部分腫瘤沒有特效的治療方法，腫瘤嚴重影響著人們的生活［1］。腫瘤免疫在腫瘤的發生發展和預后中起著關鍵作用。近年來免疫療法在腫瘤治療中逐漸開展，尤其是免疫檢查點阻斷療法［2］。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶11（serine-threonine kinase 11，STK11）也稱為肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1），位于人類染色體19p13.3區域，在調節細胞生長、存活和代謝中起重要作用［3］。STK11缺失與結直腸癌患者的不良預后密切相關［4］。樹突狀細胞中STK11缺失可通過誘導腫瘤中調節性T細胞增加，促進腫瘤的生長［5］。STK11在肝癌中過表達且與不良預后顯著相關［6］，可影響大多數惡性腫瘤患者的預后。

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迄今為止，有關STK11在腫瘤中的研究僅限于特定類型的腫瘤。尚無關于STK11與各種腫瘤之間關聯的泛癌研究。隨著公共數據庫的不斷發展和完善，可對基因進行泛癌表達分析并評估其與臨床預后及免疫的相關性［7］。因此，本研究利用數據庫分析STK11表達與各種腫瘤發生、預后及免疫的關系。

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1 材料與方法

1.1 信息獲取

通過R軟件包“edge”分析正常組織和腫瘤組織中STK11表達水平的差異。Kruskal Wallis檢驗用于分析STK11在不同正常組織和不同腫瘤細胞系中的表達水平。采用R軟件包“ggplot”繪圖。

式（3）中，XHC為人力資本存量，Ei表示i教育層次的員工比重，Hi表示i教育層次員工的受教育年限。本文將教育層次分為4層：專科以下學歷、專科學歷、本科學歷、研究生學歷（碩士和博士），受教育年限分別為12年、15年、16年、19年。

1.2 STK11在泛癌中的表達

各種腫瘤和正常組織的基因表達水平和臨床信息數據來自GTEx數據庫（https：//gtexportal.org/）和TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。其中，31種癌癥納入GTEx基因表達分析，27種癌癥納入GTEx整合分析。每個腫瘤細胞系的表達數據取自CCLE數據庫（https：//portals.broadinstitute.org/）。本研究采用ESTIMATE算法計算每個腫瘤樣品的免疫評分、基質評分和綜合評分。TIMER數據庫下載33種癌癥的6種免疫浸潤細胞的得分數據。

1.3 STK11表達與腫瘤患者預后之間的關系

采用ESTIMATE算法計算每個腫瘤樣品的免疫評分、基質評分和綜合評分，并使用R軟件包“estimate”和“ limma”根據免疫浸潤程度評估STK11表達與以上3種評分之間的關系。此外，本研究從TIMER數據庫下載了33種腫瘤的6種免疫浸潤細胞的得分數據，采用R軟件包評估STK11表達與每種免疫細胞浸潤水平之間的相關性。

1.4 STK11表達與免疫評分、基質評分和綜合評分及免疫浸潤的關系

采用單變量生存分析方法分析STK11表達與患者生存率的相關性，Kaplan-Meier方法和對數秩檢驗方法用于比較不同STK11表達水平的存活率。采用二分法將STK11在腫瘤及鄰近非癌組織中的表達水平分為STK11高表達組和低表達組。通過R軟件包“ survival”和“ survminer”進行單變量 Cox回歸分析，并繪制生存曲線。

1.5 統計學分析

采用R包 Estimate 分析單個腫瘤樣本的免疫評分、基質評分和綜合評分，33種腫瘤中STK11表達與免疫評分相關性最顯著的前3個腫瘤為多形膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）（r=-0.358，P＜ 0.001）、LUSC（r=-0.208，P＜ 0.001）和SARC（r=-0.261，P＜ 0.001），STK11表達與基質評分最顯著相關的前3個腫瘤是 ACC（r=-0.429，P＜ 0.001）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma，THCA）（r=-0.153，P＜ 0.001）和GBM（r=-0.358，P＜ 0.001），STK11表達與綜合評分最顯著相關為ACC（r=-0.429，P＜ 0.001）、LUSC（r=-0.208，P＜ 0.001）和 GBM（r=-0.358，P＜ 0.001）。這些結果表明，6種腫瘤中STK11表達與這3種評分均呈顯著負相關，見圖3。

2 結果

2.1 STK11在正常組織和腫瘤之間的差異表達

針鐵礦能夠對重金屬離子發生吸附作用，是由于針鐵礦表面具有多種活性羥基結構，這些羥基能夠與重金屬離子發生螯合作用。為進一步表征針鐵礦的表面羥基化程度，對針鐵礦樣品進行酸堿滴定，滴定結果如圖8所示。

圖1 STK11在腫瘤組織和正常組織中的表達Fig.1 Differential expression of STK11

2.2 STK11在各種腫瘤中的預后價值

本研究分析33種腫瘤中STK11表達與6種免疫細胞得分的相關性，結果顯示，STK11表達水平在7種腫瘤中與B細胞得分呈正相關，18種腫瘤中與CD4+T細胞得分呈正相關，4種腫瘤中與CD8+T細胞得分呈正相關，6種腫瘤中與中性粒細胞和巨噬細胞得分呈正相關，7種腫瘤中與樹突狀細胞得分呈正相關。此外，STK11表達水平在16種腫瘤中與CD8+T細胞得分呈負相關，6種腫瘤中與中性粒細胞得分呈負相關，11種腫瘤中與巨噬細胞得分呈負相關，3種腫瘤中與樹突狀細胞得分呈負相關（表2）。在最顯著相關的3種腫瘤中，LIHC和LUAD的STK11表達水平與B細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞得分均呈顯著正相關；而在COAD患者中，STK11表達水平與B細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞得分均呈顯著負相關，與CD4+T細胞呈正相關（圖4）。

GTEx數據庫分析結果顯示，STK11基因在大多數正常組織中過表達，其中睪丸組織中的表達水平最高（圖1A）。CCLE數據庫中21種不同正常組織的分析結果顯示，STK11在大多數正常細胞中高表達（P＜ 0.001）（圖1B），與GTEx數據的分析結果一致。各種腫瘤組織與鄰近非癌組織中STK11差異表達分析結果顯示，STK11在絕大多數腫瘤中表達上調，其中在膽管癌（cholangiocarcinoma，CHOL）和肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）的表達為極顯著上調（P＜ 0.001）；但在肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）、腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe，KICH）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）和子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）中表達呈下調（P＜ 0.01），見圖1C。考慮到TCGA中部分腫瘤樣品缺失癌旁樣品，本研究整合GTEx數據庫中正常組織的數據和TCGA腫瘤組織的數據，進行了STK11在27個腫瘤中的表達差異分析；結果顯示，在22種類型的腫瘤和正常組織之間檢測到STK11的顯著差異表達，STK11在CHOL、頭頸部鱗狀細胞癌（headand neck squamous cell carcinoma，HNSC）、KICH、肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、PAAD和直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）中的表達顯著上調，而在宮頸癌（cervical and endocervical cancer，CESC）、子宮肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）、READ、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）和肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）等16種腫瘤中STK11表達明顯低于正常組織，見圖1D。

表1 STK11表達與33種腫瘤OS的關系Tab.1 Relationship between STK11 expression and OS in 33 tumors

圖2 STK11表達與7種腫瘤 OS的關系Fig.2 Kaplan-Meier analysis of the association between STK11 expression and OS of 7 types of tumors

2.3 STK11表達與免疫評分、基質評分和綜合評分的關系

采用R軟件（版本4.0.2）對數據進行統計分析，組間比較采用t檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法、log-rank檢驗和Cox比例風險回歸模型，2個變量之間的相關性分析采用Spearman檢驗或Pearson檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

圖3 STK11表達與免疫評分、基質評分和綜合評分相關性最高的3種腫瘤Fig.3 STK11 expression in the three tumors with the highest correlation between immune score，matrix score，and ESTIMATE score

2.4 STK11表達水平與免疫浸潤水平的關系

對33種腫瘤中STK11表達水平與預后結局進行關聯分析。結果顯示，STK11表達水平與腎上腺皮質瘤（adrenocortical carcinoma，ACC）、HNSC、急性粒細胞白血病（acute myeloid leukemia，LAML）、低級別腦膠質瘤（brain lower grade glioma，LGG）、LIHC、肉瘤（sarcoma，SARC）和UCEC等7種腫瘤類型的總生存期（overall survival，OS）相關（P＜ 0.05），見表1。其中，STK11在ACC、LAML、LGG、LIHC和SARC中屬于高風險基因（HR＞1），而在HNSC（HR=0.97）和UCEC（HR=0.98）中屬于低風險基因。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，在HNSC和UCEC中STK11表達水平高的患者OS更長；而在ACC、LAML、LGG和LIHC患者中，STK11高表達患者OS更短，見圖2。

高速公路橋梁是主要的承載結構部分，必須要根據地形條件來確定結構形式，綜合比較各個方面之后才能最終確定，要保證其安全性和穩定性。

表2 不同腫瘤中STK11表達與免疫細胞浸潤的關系Tab.2 Relationship between STK11 expression and immune cell infiltration in different cancers

圖4 COAD、LIHC和LUAD中STK11表達與免疫細胞浸潤的相關性Fig.4 Correlation analysis between STK11 expression and tumor immune infiltration in COAD，LIHC，and LUAD

3 討論

通過TCGA數據庫研究STK11在各種癌和癌旁組織中的表達情況，結果顯示，STK11基因在膽管癌、肝癌等14種腫瘤中高表達。BARBIER-TORRES等［8］研究表明STK11在肝癌中過表達并致癌，預后較差的患者中STK11水平進一步升高。然而，HUANG等［9］發現肝癌患者中STK11表達下降。這與本研究結果不一致，可能與腫瘤類型、分級、分期或者不同的種族遺傳背景有關，也可能是因為STK11雖然被確定為腫瘤抑制因子，但也可能表現出促癌功能［6］。此外，在轉移性乳腺癌細胞系中，STK11蛋白水平降低，并促進了乳腺癌的轉移和侵襲；STK11表達水平在乳腺癌的不同階段之間差異很大，并且可能與腫瘤轉移和患者預后相關［10］。本研究為STK11作為泛癌預后標志物的應用提供了見解，有助于未來機制研究的潛在發展。

Kaplan-Meier生存分析結果顯示，STK11高表達與腎上腺皮質癌和腦低級別膠質瘤患者的不良預后有關。同樣，STK11高表達與肝癌不良預后相關，提示STK11可能是肝癌潛在的預后生物標志物［9］。相反，在患有胰腺癌、胸腺癌和子宮內膜癌的患者中，STK11高表達與良好的預后相關。據報道［11］，胰腺導管腺癌患者中STK11表達降低，且與患者的不良生存有關。總之，STK11可能作為多種腫瘤預后的生物標志物。

免疫微環境作為評估腫瘤細胞對免疫療法反應的標志物，影響臨床結果，STK11在腫瘤免疫中起著至關重要的作用［12-13］。浸潤的腫瘤免疫細胞對腫瘤的發生和發展有重要影響，并且可以拮抗或促進腫瘤的發生和發展［14］。前期研究［15］已表明腫瘤抑制基因STK11的失活除了對細胞周期、代謝、分化、極性和其他細胞途徑的影響外，還會導致腫瘤微環境的顯著變化。肺癌患者中，STK11缺乏可以促進免疫抑制微環境，并可能參與抗pd-1/抗pd-L1的初級抗藥［16］。同時，發生STK11突變的肺腺癌患者，免疫細胞浸潤減少，接受免疫檢查點抑制劑的患者預后更差［17］。本研究結果顯示，在33種腫瘤中，有6種腫瘤的STK11表達水平與免疫評分、基質評分和細胞浸潤評分均呈顯著負相關。其中，在肝細胞癌與肺腺癌患者中，STK11表達水平與B細胞、CD4+T細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞的正相關性極為顯著。TIMER數據庫結果顯示STK11具有參與多種腫瘤，尤其是肝細胞癌和肺腺癌的免疫調節。

綜上所述，本研究對STK11在各種惡性腫瘤的分析結果顯示，STK11基因在腫瘤和正常組織之間存在差異表達，且STK11表達與腫瘤預后相關。此外，STK11可能作為許多腫瘤的預后生物標志物，對于不同的腫瘤，其表達水平的高低將帶來不同的預后結果，需進一步研究STK11在每種腫瘤中的具體作用。此外，STK11表達與腫瘤微環境及免疫細胞浸潤之間存在相關性。其對腫瘤免疫力的影響也隨腫瘤類型而變化。這些發現可能有助于闡明STK11在腫瘤發生和發展中的作用，并可能為惡性腫瘤提供一些基于免疫的抗腫瘤治療策略，從而實現更精確和個性化的免疫治療。