異蓮心堿促進Nrf2/HO-1通路減輕缺氧/復氧致心肌細胞凋亡的機制研究

張翔 張博方

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈疾病最嚴重的表現形式,死亡率超過20%,是全球范圍內導致死亡最主要的疾病之一[1],通過靜脈溶栓、經皮冠狀動脈介入治療迅速開通梗死相關血管,恢復缺血區域血流的灌注被認為是治療AMI的重要治療措施。然而,試驗表明,缺血再灌注會引起心肌細胞額外的損傷,稱之為心肌缺血再灌注損傷(MI/RI)[2]。MI/RI機制尚不明確,目前研究者已經提出了許多潛在的病理生理機制,如鈣離子超載、氧自由基增加、炎癥、細胞凋亡等[3]。其中,細胞凋亡是一種經典的程序性細胞死亡,生理狀態下可去除不必要的細胞,在防御機制中發揮積極的作用。然而,在特殊病理狀態的刺激下,過度的細胞凋亡會對器官造成病理性損害[4]。研究證實,細胞凋亡是梗死心肌細胞死亡的主要形式,在MI/RI過程中,低氧環境會激活細胞凋亡相關信號通路,且其進程會因再灌注而進一步加快[5]。因此,抑制細胞凋亡可能是緩解MI/RI的一種有效治療策略。異蓮心堿是蓮子心提取物蓮心總堿的主要成分之一,其藥理作用廣泛,有抗氧化、抗纖維化、抗腫瘤等作用[6,7]。研究表明,異蓮心堿在心血管疾病的治療中能夠發揮積極作用,具有抗心律失常、降壓、抗血栓形成等作用[8-10]。另有研究證實,異蓮心堿在腦缺血再灌注損傷的病理過程中起到關鍵作用,發現異蓮心堿通過其抗氧化作用減輕小鼠前腦缺血再灌注損傷[11]。因此本研究在離體條件下建立心肌細胞H/R模型[12],從細胞層面探究異蓮心堿對H/R引起的心肌損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 1～3 d齡SD大鼠乳鼠,SPF級,雌雄不限,由武漢大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(鄂)2019-0013。

1.2 試劑與儀器 (1)試劑:異蓮心堿(純度:99.8%,批號:must-21100923,成都曼思特生物科技有限公司),磷酸緩沖鹽溶液(PBS,P1022)、DMEM培養基(31600)、標準胎牛血清(S9020),北京索萊寶科技有限公司;LDH試劑盒(A020-2-2)、CK-MB試劑盒(H197-1-1)、Tunel試劑盒(G001-4-2),南京建成生物工程研究所;CCK-8試劑盒(C0038),DAPI染色液(C1006),上海碧云天生物技術有限公司;α-actinin抗體(ab137346,1∶1 000)、Bcl-2抗體(ab182858,1∶2 000)、Bax抗體(ab32503,1∶4 000),Caspase-3抗體(ab32351,1∶5 000),Nrf2抗體(ab62352,1∶2 000),HO-1抗體(ab52947,1∶2000),英國Abcam。(2)儀器:BS-180全自動生化分析儀,中國邁瑞;BX50熒光顯微鏡,日本Olympus;酶標儀、CFX96熒光定量PCR儀,GelDoc Go全自動凝膠成像系統,美國Bio-Rad。

1.3 方法

1.3.1 原代細胞的提取與鑒定[13]:采用8次消化法提取原代心肌細胞。乳鼠麻醉并充分消毒后,打開胸腔迅速取出完整心臟置入PBS液中。剪去心臟大血管及心房組織,心室留用。心臟組織剪碎后置入0.25%胰酶和0.08%膠原酶混合液中,37℃下消化5 min,待分層后去除上清液,重復消化數次,直至心肌組織轉為白絮狀。消化完成后,離心(1 500 r/min,5 min)棄上清液,含10%胎牛血清的DMEM培養基重懸底部心肌細胞,37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育。利用差速貼壁法去除成纖維細胞,未貼壁細胞重懸后接種于培養皿中。取培養48 h已爬片心肌細胞,4%多聚甲醛固定15 min,漂洗后0.1%Triton X-100室溫通透5 min。山羊血清封閉60 min,滴加1∶100稀釋α-actinin抗體,4℃過夜,PBS清洗后加入相應二抗避光孵育1 h,DAPI復染后封片置熒光顯微鏡下觀察純度。

1.3.2 H/R損傷模型的建立:惰性氣體(95%N2+5%CO2)飽和DMEM培養基,后替換正常培養基,并將培養基置入充滿惰性氣體的缺氧盒中;缺氧處理6 h后,取出培養皿,經PBS溶液清洗后用正常培養基繼續培養6 h,得H/R損傷心肌細胞。

1.3.3 不同濃度異蓮心堿對H/R損傷心肌細胞活力的影響:原代細胞隨機分為5組:對照組(正常培養)、H/R組、H/R+1 μg/ml異蓮心堿、H/R+5 μg/ml異蓮心堿、H/R+10 μg/ml異蓮心堿,每組6只。異蓮心堿給藥時間為復氧開始時,并繼續培養24 h。用CCK-8試劑盒檢測5組復氧后的心肌細胞活力,確定異蓮心堿的最佳作用濃度。

1.3.4 檢測CK-MB和LDH的水平:復氧后,將5組心肌細胞接種于96孔板中,3 000 r/min離心5 min,每孔取上清液按試劑盒說明書操作,最后用全自動生化分析儀測肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。

1.3.5 心肌細胞凋亡率的檢測:復氧結束后,采用TUNEL染色法檢測3組細胞凋亡情況,具體步驟見TUNEL試劑盒,利用光學顯微鏡觀察細胞凋亡情況,胞核染紅色即為陽性凋亡細胞,隨機選取5個視野觀察陽性細胞數及總細胞數,計算凋亡率。凋亡率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.3.6 RT-PCR檢測mRNA的表達:提取心肌細胞中的總RNA,按照反轉錄試劑盒說明書操作,對各組心肌細胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2及HO-1等基因的mRNA表達量進行測定。反應條件:95℃ 2 min;95℃ 10 s、60℃ 15 s、72℃ 40 s,40個循環。以GAPDH為內參。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.7 免疫印跡技術檢測蛋白的表達:3組細胞經裂解液處理后離心提取總蛋白,BCA試劑盒檢測總蛋白濃度,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,再移到硝酸纖維膜上。5%脫脂牛奶封閉,于4℃下與半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、核因子E2相關因子2(Nrf2)、血紅素加氧酶-1(H0-1)對應的一抗孵育過夜,隨后與相應二抗室溫孵育1 h,化學發光法顯色,以GAPDH為內參,Image Lab軟件分析灰度值。

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2 結果

2.1 原代心肌細胞鑒定與異蓮心堿最佳作用濃度 熒光顯微鏡下觀察原代細胞,α-actinin染色陽性為心肌細胞(紅色),其純度高。異蓮心堿處理6、12 h時,相對于H/R組,1 μg/ml和5 μg/ml異蓮心堿均能明顯升高細胞活性,且5 μg/ml效果更為顯著(P<0.05),而在作用24 h時,兩種濃度效果無明顯差異。此外,10 μg/ml異蓮心堿會導致細胞活力下降,綜合考慮實驗時長因素,選用5 μg/ml為最佳作用濃度用于后續實驗。見圖1,表2。

圖1 心肌細胞鑒定(×400)

表2 CCK-8檢測不同濃度異蓮心堿對細胞活力的影響 n=6,

2.2 異蓮心堿對LDH和CK-MB水平的影響 與CON組比較,H/R組培養基中LDH和CK-MB釋放量顯著升高(P<0.05);與H/R組比較,H/R+IL組LDH和CK-MB釋放量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組LDH和CK-MB釋放量比較 n=6,U/L,

2.3 異蓮心堿對心肌細胞凋亡的影響 H/R處理后,心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.01),TUNEL染色陽性的細胞數目明顯增加。而異蓮心堿能減輕H/R誘導的細胞凋亡,與H/R組相比,H/R+IL組TUNEL染色陽性的細胞明顯減少(P<0.01)。見圖2,表4。

圖2 3組心肌細胞凋亡情況(×200)

表4 3組心肌細胞凋亡率 n=6,%,

2.4 異蓮心堿對Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達的影響 CON組比較,H/R組心肌細胞Bax及Caspase-3的mRNA表達量顯著升高(P<0.001),Bcl-2的mRNA表達明顯降低(P<0.01),Bcl-2/Bax值下降;與H/R組比較,H/R+IL組心肌細胞Bax及Caspase-3的mRNA表達明顯下調(P<0.05),Bcl-2表達顯著增高(P<0.05),Bcl-2/Bax值升高。見表5。

表5 3組Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA及蛋白表達情況 n=6,

2.5 異蓮心堿對Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白表達的影響 與CON組比較,H/R組心肌細胞Bax及Caspase-3的蛋白表達水平顯著升高(P<0.001),Bcl-2的蛋白表達明顯降低(P<0.01),Bcl-2/Bax值下降;而相對于H/R組,H/R+IL組心肌細胞Bax及Caspase-3的蛋白表達明顯下調(P<0.01),Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax值升高。見圖3,表5。

圖3 3組Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA及蛋白表達比較(n=6)

2.6 異蓮心堿對Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達的影響 與CON組比較,H/R組心肌細胞Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達量顯著下降(P<0.01);與H/R組比較,H/R+IL組心肌細胞的Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖4,表6。

圖4 3組Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達比較

表6 3組Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達情況 n=6,

3 討論

冠狀動脈急性的持續性缺血可導致心肌梗死,目前心內科多采用靜脈溶栓治療、經皮冠狀動脈介入治療等方式開通梗死相關血管,通過改善心肌細胞的供血來緩解缺血引起的心肌代謝功能障礙,大量的證據表明,不同階段的缺血組織閉塞后動脈重新開放會引起MI/RI。雖有研究證實,葡萄糖-胰島素-鉀(Gik)、尼可地爾及利鈉肽等傳統藥物對MI/RI有一定的治療作用,但其本身也會帶來一定的不良反應,尤其是對泌尿和循環系統的有害影響[14,15]。因此,尋找理想的藥物來緩解MI/RI損傷十分必要。

心肌細胞凋亡是MI/RI的最終病理結果,在復雜的MI/RI機制中也是較重要的一類,而線粒體途徑是細胞凋亡過程中最重要的途徑之一,當細胞暴露于壓力條件下時,線粒體膜會觸發一系列改變,mPTP打開,促凋亡蛋白細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中,組裝到凋亡體中切割前體Caspase-9,激活的Caspase-9切割前體Caspase-3,最終活化成裂解的Caspase-3,導致DNA損傷,引起細胞凋亡[16,17]。Caspase屬于腫瘤壞死因子受體家族,目前被認為是死亡受體通路中的凋亡信號轉導基因,Caspase-3是死亡受體通路的下游蛋白,執行細胞凋亡程序,在細胞凋亡和炎癥中具有調節作用。同時,早期凋亡信號還來源于Bcl-2家族,Bcl-2和Bax是該家族參與細胞凋亡的重要角色,Bcl-2和Bax參與細胞色素c的釋放過程,其含量變化可阻斷Caspase-3上游信號通路[18]。因此,Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達量決定了心肌細胞的凋亡情況,Bcl-2/Bax比值升高,Caspase-3活性降低能抑制心肌細胞凋亡,減輕心肌細胞損傷。本實驗結果顯示,H/R損傷心肌細胞中,在mRNA和蛋白表達水平上,Bcl-2/Bax比值降低,細胞凋亡信號Caspase-3活性升高,而異蓮心堿能逆轉這種作用,升高Bcl-2/Bax比值,降低Caspase-3活性,從而抑制MI/RI引起的心肌細胞凋亡。Nrf2/HO-1通路負責維持氧化還原狀態的平衡,并通過減輕氧化應激抑制細胞凋亡,研究顯示,Nrf2/HO-1通路可通過抗氧化、抗炎及抗凋亡等多種方式來調節心肌細胞的凋亡[19-21]。本研究證實異蓮心堿能顯著增加H/R處理后心肌細胞中Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達,從而直接減輕細胞凋亡,抑制H/R導致的心肌損傷。

既往研究表明,異蓮心堿能顯著減少前腦組織中MDA及ROS的生成,并增強線粒體ATPase的活性,從而降低自由基引起的細胞損傷,減輕小鼠前腦缺血再灌注損傷[11]。而本研究顯示,5 μg/ml異蓮心堿能顯著降低H/R心肌細胞的心肌酶CK-MB 和LDH的釋放,并降低心肌細胞凋亡率。且異蓮心堿在基因和蛋白水平均能有效調節細胞凋亡相關因子Bcl-2,Bax及Caspase-3的表達,抑制細胞凋亡,而這種作用可能與異蓮心堿促進Nrf2/HO-1通路密切相關[22]。

綜上所述,異蓮心堿可能由調節Nrf2/HO-1通路來緩解細胞凋亡從而有效減輕H/R引起的心肌細胞損傷,為MI/RI的治療提供了潛在的藥物治療策略。