大黃素調控miR-16-5p/STAT3對心肌梗死大鼠模型保護作用機制研究

謝小芳 趙展慶 符妹垂

心肌梗死后心肌組織出現大面積變性壞死,造成嚴重的心力衰竭及心率失常,隨時危及患者生命[1,2]。持續性缺血缺氧觸發的心肌組織強烈炎性級聯反應是造成心肌梗死后心功能損傷的主要病理基礎,抗炎干預可有效減輕心肌梗死后心肌細胞凋亡和心肌組織損傷,改善心功能[3,4]。研究顯示miR-16-5p在缺血性心肌損傷中起著重要的調節作用,下調miR-16-5p表達可有效保護心肌細胞免受缺氧/復氧誘導的損傷[5],抑制Janu激酶2(Janus Kinase 2,JAK2)/信號轉導子和轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號激活可抑制缺血缺氧誘導的心肌細胞凋亡,有效保護心肌梗死大鼠心臟[6];另有研究證明,miR-16-5p可調控STAT3表達,進而介導神經系統疾病和糖尿病的發生發展[7],因此下調miR-16-5p/STAT3信號可能是防治心肌梗死后心損傷的有效策略。大黃素具有顯著抗炎、抗心肌缺血、抗凋亡特性,能用于心血管疾病的防治[8],可發揮抗氧化應激以及抗凋亡功效而促使缺氧復氧心肌細胞存活[9],還可抑制JAK2/STAT3信號激活并緩解小鼠動脈粥樣硬化病變[10],因而推測大黃素可能通過miR-16-5p抑制STAT3而對心肌梗死大鼠發揮保護作用,本文以不同劑量大黃素處理心肌梗死模型大鼠,對此推測做驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠,體重205～220 g,雄性,7周齡左右,SPF級,購自杭州啟真實驗動物科技有限公司,合格證號:SCXK(浙)2022-0005。大鼠在屏障環境的動物房內飼養,飼養條件:照明為晝夜12 h/12 h交替,溫度22.5～25.5℃、相對濕度55%～65%。

1.2 主要材料及試劑 miR-16-5p agomir、miR-16-5p agomir陰性對照、miR-16-5p及U6引物由上海吉瑪制藥技術有限公司提供;大黃素(純度≥98%,貨號E8390)、一步法熒光定量PCR試劑盒(貨號T2210)、2,3,5氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride,TTC)染色液(2%,貨號G3005),北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑(貨號:AHF1813A),美國Invitrogen公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號ab236712)、HE染色試劑盒(貨號ab245880)、大鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)ELISA試劑盒(貨號ab255730)、TUNEL染色試劑盒(貨號ab206386)、兔抗大鼠Anti-β-actin一抗(貨號ab8227)、兔源抗大鼠Anti-p-STAT3抗體(貨號ab76315)、兔源抗大鼠Anti-Caspase-3抗體(貨號ab184787)、兔源抗大鼠Anti-STAT3抗體(貨號ab68153)、辣根過氧化物酶標記小鼠抗兔二抗(貨號ab99697)、兔源抗大鼠Anti-Bax抗體(貨號ab32503),美國Abcam公司等。

1.3 主要儀器 小動物呼吸機(型號R407),購自深圳瑞沃德生命科技有限公司;超高分辨率小動物超聲成像系統(型號Vevo3100),購自加拿大Visualsonics Inc公司;石蠟切片機(型號ARM-2216),購自湖北安立信醫療實業有限公司;實驗室雙目生物顯微鏡(型號CM1000),購自深圳市星明光學儀器有限公司;酶標儀(型號HBS-1096C),購自南京德鐵實驗設備有限公司;標準型垂直電泳系統(型號SE400)、全濕電轉印系統(型號TE62),購自美國Amersham公司等。

1.4 方法

1.4.1 分組及處理:將大黃素、miR-16-5p agomir、miR-16-5p agomir陰性對照溶于0.9%氯化鈉溶液,制為6、12 ml/kg大黃素藥液、20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液和20 nmol/ml miR-16-5p agomir陰性對照藥液備用。大鼠隨機分為假手術組、模型組、大黃素低劑量組、大黃素高劑量組、miR-16-5p agomir組、miR-16-5p agomir陰性對照組、大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組,每組12只。大黃素低劑量組、大黃素高劑量組大鼠灌胃30、60 mg/kg大黃素(6、12 ml/kg的大黃素藥液均5 ml/kg,1次/d)[11],同時尾靜脈注射5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(2次/周);miR-16-5p agomir組、miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠灌胃5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(1次/d),同時尾靜脈注射miR-16-5p agomir及miR-16-5p agomir陰性對照各100 nmol/kg(20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液和20 nmol/ml miR-16-5p agomir陰性對照藥液均5 ml/kg,2次/周)[12];大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組灌胃60 mg/kg大黃素(12 ml/kg的大黃素藥液5 ml/kg,1次/d),另尾靜脈注射miR-16-5p agomir 100 nmol/kg(20 nmol/ml miR-16-5p agomir藥液5 ml/kg,2次/周);假手術組和模型組大鼠灌胃5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(1次/d),同時尾靜脈注射5 ml/kg的0.9%氯化鈉溶液(2次/周),7組均干預處理1周。

1.4.2 超聲檢測心功能:藥物處理后24 h,參照文獻[13]建立心肌梗死模型:以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(劑量為1.6 ml/kg),氣管插管后連接小動物呼吸機輔助呼吸,胸部脫毛備皮后于左側胸骨第3、4肋間開胸,暴露心臟后找到,冠狀動脈左前降支,對其進行結扎,直至左心室前壁由紅變蒼白及心電圖ST段抬高即表示造模成功,假手術組大鼠開胸后僅穿線不結扎,30 min后放開結扎線縫合,恢復心臟血流2 h后采用小動物超聲成像系統檢測大鼠心功能指標:左心室收縮末期內徑(LVDS)、左心室射血分數(EF)、左心室舒張末期內徑(LVDD),測3個心動周期取平均值。

1.4.3 采集標本:心功能檢測結束后,每組取6只大鼠采集其頸動脈血,離心得到血清標本,-80℃冰箱備用;開胸取出心臟,取梗死區附近的心肌組織約0.6 g加入RAPI緩沖液研碎勻漿,離心得到蛋白樣品液,以BCA法測出總蛋白濃度后存在-80℃冰箱備用;再次取梗死區附近的心肌組織約0.4 g于液氮中備用;剩余心肌組織蒸餾水清洗、10%甲醛固定、梯度(80%、90%、95%、100%)乙醇脫水、熱石蠟包埋、切片備用。

1.4.4 TTC染色檢測7組大鼠心肌梗死面積:每組剩余的6只大鼠開胸取出心臟,沿冠狀面切為厚片,分別浸沒入2%的TTC染色液中避光孵育20 min染色,然后以10%甲醛固定后拍照,計算心肌梗死面積,公式為:心肌梗死面積=梗死面積/切片總面積×100%。

1.4.5 HE和TUNEL染色分別檢測7組大鼠心肌組織病理變化、心肌細胞凋亡:取出1.4.3中的心肌組織石蠟切片,二甲苯脫蠟、梯度(100%、95%、80%、75%)乙醇水化,分別進行HE和TUNEL染色(各染3張),洗片后采用實驗室雙目生物顯微鏡攝取HE和TUNEL染色后的切片,并采用Image J軟件分析TUNEL染色后的切片圖像并定量其視野中凋亡細胞數及總心肌細胞數,計算心肌細胞凋亡率,公式為:心肌細胞凋亡率=凋亡細胞數/總心肌細胞數×100%。

1.4.6 ELISA法測定7組大鼠血清及心肌組織炎性因子IL-1β、TNF-α水平:取出1.4.3中存在-80℃的血清和心肌組織樣品液并解凍,每組取0.24 ml,采用ELISA試劑盒測定血清及心肌組織中IL-1β、TNF-α水平,參照各自試劑盒說明書中步驟進行。

1.4.7 實時熒光PCR檢測7組大鼠心肌組織miR-16-5p水平:取1.4.3中存在液氮的心肌組織,加入Trizol試劑研磨后提取并測出總RNA濃度,每組取適量總RNA采用一步法熒光定量PCR試劑盒檢測出每組大鼠miR-16-5p、 U6基因Ct值,以U6做內參對照并以2-ΔΔCt法量化miR-16-5p的相對表達。見表1。

表1 引物序列

1.4.8 免疫印跡法檢測7組大鼠心肌組織凋亡蛋白(Bax、Caspase-3)及STAT3 表達:取1.4.6中剩余的心肌組織樣品液,100℃煮沸變性蛋白,每組取適量蛋白電泳(120 V恒壓,85 min)分離,電轉(40 mA穩流,85 min)移到硝酸纖維膜,5%牛血清白蛋白封閉膜上蛋白非特異抗原后將STAT3、p-STAT3、β-actin、Bax、Caspase-3蛋白條帶剪下,分別孵育兔源抗大鼠Anti-STAT3、p-STAT3、β-actin、Bax、Caspase-3抗體,洗膜后孵育辣根過氧化物酶標記小鼠抗兔二抗,化學發光顯色7組蛋白條帶后攝取其圖像,采用Image-J軟件定量7組蛋白條帶灰度值后分析得出相對表達量。

2 結果

2.1 大黃素對7組大鼠心功能的影響 與假手術組比較,模型組大鼠LVDS、LVDD明顯升高(P<0.05),EF明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠LVDS、LVDD均降低(P<0.05),EF均升高(P<0.05);大黃素高劑量組大鼠LVDS、LVDD相比大黃素低劑量組進一步降低(P<0.05),EF進一步升高(P<0.05);miR-16-5p agomir組大鼠LVDS、LVDD升高(P<0.05),EF降低(P<0.05);miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠LVDS、LVDD、EF無明顯變化(P>0.05)。與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠LVDS、LVDD升高(P<0.05),EF降低(P<0.05)。見表2。

表2 7組大鼠心功能指標LVDS、LVDD、EF

2.2 大黃素對7組大鼠心肌梗死的影響 與假手術組比較,模型組大鼠心肌梗死面積明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌梗死面積均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠心肌梗死面積比大黃素低劑量組進一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌梗死面積升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠心肌梗死面積無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌梗死面積升高(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 7組大鼠心肌梗死面積

2.3 大黃素對7組大鼠心肌組織病理形態的影響 假手術組大鼠心肌組織形態正常無病理變化;模型組大鼠心肌細胞排列紊亂,部分心肌纖維變性出現灶性壞死,組織內有炎性細胞浸潤;與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌組織病理損傷均減輕,大黃素高劑量組大鼠心肌組織病理損傷進一步減輕,miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織病理損傷加重,miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠心肌病理損傷無明顯變化;與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織病理損傷加重。見圖2。

圖2 7組大鼠心肌組織病理變化(HE染色×200)

2.4 大黃素對7組大鼠心肌纖維化的影響 與假手術組比較,模型組大鼠心肌細胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率相比大黃素低劑量組進一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠心肌細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組相比,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)。見圖3,表4。

圖1 TTC染色檢測7組大鼠心肌梗死面積

圖3 7組大鼠心肌纖維化(TUNEL染色×200)

表4 7組大鼠心肌細胞凋亡率

2.5 大黃素對7組大鼠心肌組織凋亡蛋白(Bax、Caspase-3)、miR-16-5p/STAT3信號因子表達的影響 與假手術組比較,模型組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達、miR-16-5p表達、p-STAT3/STAT3明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達、miR-16-5p表達、p-STAT3/STAT3均降低(P<0.05),大黃素高劑量組大鼠比大黃素低劑量組進一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對照組大鼠心肌組織無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠心肌組織Bax及Caspase-3蛋白表達、miR-16-5p表達、p-STAT3/STAT3升高(P<0.05)。見表5,圖4。

圖4 免疫印跡檢測7組大鼠心肌組織凋亡蛋白及STAT3蛋白表達;A 假手術組;B 模型組;C 大黃素低劑量組;D 大黃素高劑量組;E miR-16-5p agomir組;F miR-16-5p agomir陰性對照組;G 大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組

表5 7組大鼠心肌組織凋亡蛋白、miR-16-5p/STAT3信號因子相對表達水平

2.6 大黃素對7組大鼠血清及心肌組織炎性因子的影響 與假手術組比較,模型組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與模型組比較,大黃素低、高劑量組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05),大黃素高劑量組相比大黃素低劑量組進一步降低(P<0.05),miR-16-5p agomir組升高(P<0.05),miR-16-5p agomir陰性對照組無明顯變化(P>0.05);與大黃素高劑量組比較,大黃素高劑量+miR-16-5p agomir組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表6。

表6 7組大鼠血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平

3 討論

口服硝酸酯類藥物、介入手術等是心肌梗死常用臨床治療手段,但患者心臟功能恢復及預后不甚理想,因此探尋療效更好的治療方式有重要價值[14,15]。本文通過冠狀動脈左前降支結扎法建立心肌梗死模型,結果顯示造模大鼠血清及心肌組織炎性因子水平明顯升高,促使大鼠心肌細胞凋亡,心肌細胞排列紊亂,部分心肌纖維變性出現灶性壞死,組織內有炎性細胞浸潤,嚴重損害心功能,揭示心肌梗死模型建立成功。

通過抑制炎癥水平和心肌細胞凋亡可明顯減輕心肌梗死大鼠心功能損傷[16,17]。大黃素可發揮抗氧化、抗心肌缺血、抗炎、抗凋亡的功效,在心血管疾病的治療中具有很好的應用前景[9],通過降低氧化應激及抑制凋亡等途徑減輕硫酸吲哚酚誘導的心肌細胞損傷[18],并通過增強抗氧化功能而緩解大鼠心肌缺血再灌注損傷,保護其心功能[11]。本文以不同劑量大黃素處理心肌梗死大鼠,均可降低其LVDS、LVDD、心肌梗死面積、心肌細胞凋亡率、血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平、心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達,升高EF,減輕大鼠心肌組織病理損傷,表明大黃素可降低炎性因子表達,抑制炎癥,減輕心肌細胞凋亡及組織損傷,改善心功能,最終起到心保護作用,且劑量越高作用越強,進一步證實了大黃素對心肌損傷的防治作用。

miR-16-5p和STAT3是調控細胞凋亡、炎癥、纖維化的重要因子,在各種心臟疾病發病機制中發揮著重要調控作用,miR-16-5p在缺血性擴張型心肌病患者血漿中表達升高,可在體外促進內質網應激誘導的心肌細胞凋亡,通過抑制細胞凋亡和炎癥可有效緩解心臟損傷;降低STAT3磷酸化可顯著抑制膠原蛋白表達,通過對抗心肌纖維化改善心肌梗死引起的心衰,保護心功能[19]。本文結果顯示以miR-16-5p agomir上調心肌梗死大鼠miR-16-5p表達,可升高炎性因子及STAT3磷酸化水平,增強大鼠炎癥和心肌細胞凋亡,加重其心肌組織及心功能損傷,而大黃素可降低心肌梗死大鼠miR-16-5p表達及STAT3磷酸化,表明miR-16-5p/STAT3信號參與介導心肌梗死的發生及大黃素對心肌梗死大鼠的治療過程;以大黃素處理心肌梗死大鼠同時采用miR-16-5p agomir上調miR-16-5p表達,相比大黃素單獨處理,可降低大鼠EF,升高其LVDS、LVDD、心肌梗死面積、心肌膠原纖維占比、血清及心肌組織IL-1β、TNF-α水平、心肌組織Bax、Caspase-3蛋白表達、miR-16-5p表達及p-STAT3/STAT3,加重大鼠心肌組織病理損傷,表明上調miR-16-5p表達可減弱大黃素的抗炎功能,消除其對心肌梗死大鼠心肌組織損傷和心肌細胞凋亡的減輕作用,最終逆轉大黃素對心功能的保護作用,揭示大黃素對心肌梗死大鼠發揮保護作用是通過下調miR-16-5p實現的。

綜上所述,大黃素可通過下調miR-16-5p而減弱STAT3磷酸化,從而降低炎性因子表達,抑制炎癥,減輕心肌梗死大鼠心肌組織損傷和心肌細胞凋亡,最終修復大鼠心功能,發揮心保護作用,阻斷miR-16-5p/STAT3信號傳導可能是其藥理機制之一,本文為大黃素用于心肌梗死的臨床治療提供了新的理論依據及科學資料,有利于大黃素的開發應用。