miR-150-5p靶向IGF2BP2抑制口腔鱗癌惡化的研究

田國永 李玲 呂志軍

口腔癌是口腔頜面部最高發(fā)的惡性腫瘤,其中口腔鱗狀細胞癌占90%以上,是口腔癌最主要的組織病理類型[1]。目前,雖然口腔鱗癌的治療技術取得了進步,但由于診斷的推遲,生存率并不十分理想[2,3]。腫瘤的轉移和復發(fā)是口腔鱗癌最致命的,研究表明,多數(shù)發(fā)生轉移的患者生存不超過1年[4]。因此,了解口腔鱗癌相關分子機制對開發(fā)特異性診斷方法和個體化治療策略至關重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一種小分子單鏈非編碼RNA,可通過與靶mRNA的3’UTR結合,對靶mRNA進行負向調控,誘導其降解并干擾翻譯過程,在生物過程中發(fā)揮轉錄后調控作用[5,6]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA表達失調可作為抑癌因子或促癌因子,參與腫瘤的發(fā)生,如miR-204-3p、miR-19a-3p、miR-145-5p、miR-200a-3p、miR-152等[7-11]。miR-150-5p被報道在口腔鱗癌中表達失調,具有抑癌作用[12]。但其調控口腔鱗癌細胞惡性進展的作用及機制還有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集 收集在我院進行手術治療的170例口腔鱗癌患者的癌組織和癌旁正常組織樣本。術中切除組織樣本,用流水沖洗后,立即放入液氮,然后置于超低溫冰箱中保存。所有患者術前均為進行放化療、免疫治療等輔助治療,并同意樣本采集。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染 (1)人口腔上皮膠質細胞系HOK和口腔鱗癌細胞株HN6、SCC-25和CAL-27均購自中國科學院上海細胞庫。在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素混合液的DEME培養(yǎng)基中,置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)miR-150-5p 模擬物/抑制物(mimics/inhibitors,分別記為miR-150-5p和anti-miR-150-5p)及它們的陰性對照(分別記為miR-con和anti-miR-con)、靶向IGF2BP2的siRNA序列(記為si-IGF2BP2)及其無意義siRNA(si-con),均由廣州銳博生物有限公司合成提供。分別使用Lipofectamine 3000試劑轉染CAL-27細胞。

1.3 實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR) 組織或細胞總RNA使用Trizol試劑提取,之后使用逆轉錄酶進行逆轉錄反應,合成cDNA。然后,以cDNA為模板,使用ABI SYBR Green熒光定量試劑盒進行qRT-PCR反應。實驗中使用引物序列如下:miR-150-5p正向5’-GTATGATCTCCCAACCCTTGTACCAG-3’,反向5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’;IGF2BP2正向5’-GGAACAAGTCAACACAGACACA-3’,反向5’-AACTGATGCCCGCTTAGCTT-3’;U6正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA -3’,反向5’- CGAATTTGCGTGTCATCCT-3’;GAPDH正向5’- AAGGCTGTGGGCAAGGTCATC-3’,反向5’- GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGG -3’。結果分別以U6和GAPDH為內參對照,采用2-ΔΔct法計算miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA的相對表達水平。

1.4 Western blot 使用RIPA裂解液裂解組織或細胞。蛋白裂解液在95℃沸水中變性后,取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳,將分離的蛋白轉移至PVDF膜。然后,使膜分別與抗IGF2BP2和抗GAPDH一抗稀釋液,4℃孵育過夜;洗膜,使膜與辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下孵育2 h。洗膜,將膜放入ECL發(fā)光液中顯色,使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.5 Cell Counting Kit-8(CCK8)實驗 取轉染后,生長狀態(tài)良好的CAL-27細胞,經常規(guī)消化、計數(shù),制成單細胞懸液。將細胞懸液接種至96孔板,每孔約3×103個細胞,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,每孔加入10 μl的CCK8試劑,孵育4 h。酶標儀下檢測每孔490 nm處的吸光度值。

1.6 EdU實驗 將生長狀態(tài)良好的細胞,以每孔4×103細胞接種于96孔板;培養(yǎng)24 h后,每孔加入100 μl的EdU溶液(50 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)2 h,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗細胞2次;每孔加入4%多聚甲醛固定液,室溫固定30 min,然后加入甘氨酸脫色;使用Apollo染色液,室溫下,避光染色30 min,然后加入0.5%TritonX-100滲透劑脫色10 min,PBS清洗細胞;每孔加入100 μl的DAPI反應液,室溫孵育30 min,PBS清洗細胞;顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡。收集對數(shù)生長期的細胞,離心后,棄去培養(yǎng)液;使用1×Binding Buffer重懸細胞,室溫下放置15 min;離心,清洗細胞1次;4℃下,依次向細胞中加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液,避光孵育;流式細胞儀上機檢測細胞凋亡情況。

1.8 劃痕實驗 首先在6孔板的背面劃線,然后將細胞懸液平鋪在6孔板內,過夜培養(yǎng);第2日用滅菌槍頭垂直于背后標記線,進行劃痕,然后用PBS沖洗細胞,以除去劃下來的細胞;加入無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),并于0 h和24 h進行拍照。根據(jù)細胞遷移距離計算劃痕愈合率。

1.9 Transwell實驗 用無血清的培養(yǎng)液,將轉染后的CAL-27細胞制成濃度為5×105/ml的細胞懸液。取200 μl細胞懸液加入Transwell上室內,另取600 μl含血清的培養(yǎng)液加入24孔板下室內,然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;取出Transwell上室,用濕棉簽輕輕擦拭掉上層未遷移的細胞,然后放入甲醇中固定,再用結晶紫染色;顯微鏡下隨機觀察5個視野區(qū)的遷移細胞,拍照并計數(shù)。細胞侵襲實驗中提前在Transwell中鋪設Matrigel基質膠,其它步驟同細胞遷移。

1.10 雙熒光素酶實驗 將含有miR-150-5p結合位點的IGF2BP2的3’UTR序列構建雙熒光素酶報告基因載體,然后分別與miR-con、miR-150-5p、anti-miR-con和anti-miR-150-5p共轉染CAL-27細胞,轉染48 h后,檢測細胞中熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-150-5p和IGF2BP2在口腔鱗癌組織和細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示,與癌旁組織比較,口腔鱗癌組織中miR-150-5p相對表達水平明顯降低,而IGF2BP2 mRNA相對表達水平明顯升高;與HOK細胞比較,口腔鱗癌細胞株HN6、SCC-25和CAL-27中miR-150-5p相對表達水平明顯降低,而IGF2BP2 mRNA相對表達水平明顯升高。Western blot結果顯示,與癌旁組織比較,口腔鱗癌組織中IGF2BP2蛋白表達水平明顯升高;與HOK細胞比較,口腔鱗癌細胞株HN6、SCC-25和CAL-27中IGF2BP2 蛋白表達明顯升高。K-M生存分析顯示,癌組織中miR-150-5p高表達的患者的生存率明顯高于miR-150-5p低表達患者,而IGF2BP2高表達患者的生存率明顯低于IGF2BP2低表達患者。Pearson相關性分析顯示,癌組織中miR-150-5p表達與IGF2BP2 mRNA表達呈顯著負相關關系。此外,starbase數(shù)據(jù)庫分析顯示,miR-150-5p和IGF2BP2的差異表達均與口腔鱗癌患者預后相關。見圖1、2,表1、2。

表2 miR-150-5p和IGF2BP2在各細胞株中的表達

圖1 miR-150-5p和IGF2BP2表達與口腔鱗癌患者生存率關系以及miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA相關性分析;A miR-150-5p表達與口腔鱗癌患者生存率關系;B IGF2BP2表達與口腔鱗癌患者生存率關系;C 口腔鱗癌患者癌組織中miR-150-5p和IGF2BP2 mRNA相關性分析;D starbase數(shù)據(jù)庫分析miR-150-5p表達與患者生存率關系;Estarbase數(shù)據(jù)庫分析IGF2BP2表達與患者生存率關系

圖2 Western blot檢測各細胞株中IGF2BP2蛋白表達

2.2 過表達miR-150-5p或沉默IGF2BP2抑制口腔鱗癌細胞CAL-27增殖,并誘導細胞凋亡 CCK8和EdU實驗檢測細胞增殖,結果顯示,與NC和miR-con組比較,miR-150-5p組細胞存活率和EdU陽性率均明顯降低;與NC和si-NC組比較,si-IGF2BP2組細胞存活率和EdU陽性率均明顯降低。流式細胞術檢測細胞凋亡率,結果顯示,與NC和miR-con組比較,miR-150-5p組細胞凋亡率明顯升高;與NC和si-NC組比較,si-IGF2BP2組細胞凋亡率明顯升高。見圖3,表3。

表3 過表達miR-150-5p和沉默IGF2BP2對CAL-27細胞增殖和凋亡的影響

圖3 過表達miR-150-5p和沉默IGF2BP2對CAL-27細胞增殖和凋亡的影響;A Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達;B EdU染色檢測細胞增殖;C 流式細胞術檢測細胞凋亡

2.3 過表達miR-150-5p或沉默IGF2BP2抑制口腔鱗癌細胞CAL-27遷移和侵襲 劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲,結果顯示,與miR-con組比較,miR-150-5p組細胞的劃痕愈合率降低,細胞遷移和侵襲數(shù)目減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與si-con組比較,si-IGF2BP2組細胞的劃痕愈合率降低,細胞遷移和侵襲數(shù)目減少,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4,表4。

表4 過表達miR-150-5p和沉默IGF2BP2抑制CAL-27細胞的遷移和侵襲

圖4 細胞遷移和侵襲檢測;A 劃痕實驗檢測細胞遷移能力;B Transwell 法檢測細胞遷移和侵襲能力

2.4 miR-150-5p靶向IGF2BP2 分析在線數(shù)據(jù)庫TargetScan,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p與IGF2BP2的3’UTR具有互補結合位點。進一步雙熒光素酶報告基因實驗證實,miR-150-5p能夠與IGF2BP2的3’UTR靶向結合。見圖5,表5。

表5 雙熒光素酶報告實驗結果

圖5 miR-150-5p靶向IGF2BP2;A miR-150-5p與IGF2BP2靶向結合序列;B Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達

2.5 過表達IGF2BP2逆轉miR-150-5p對口腔鱗癌細胞CAL-27增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 在過表達miR-150-5p的CAL-27細胞中同時轉染IGF2BP2過表達質粒,進行功能拯救實驗,結果顯示,與miR-150-5p+pcDNA組比較,miR-150-5p+pcDNA-IGF2BP2組細胞中IGF2BP2蛋白表達升高,細胞增殖活性和EdU陽性率升高,凋亡率降低,劃痕愈合率升高,遷移和侵襲數(shù)目增多,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖6,表6。

表6 同時過表達miR-150-5p和IGF2BP2對CAL-27細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖6 同時過表達miR-150-5p和IGF2BP2對CAL-27細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響;A EdU染色檢測細胞增殖;B Western blot檢測IGF2BP2蛋白表達;C 流式細胞術檢測細胞凋亡;D 劃痕實驗檢測細胞遷移;E Transwell檢測細胞遷移和侵襲

3 討論

miRNA作為一種短鏈非編碼RNA,廣泛參與生命活動的調節(jié),尤其是癌癥[13]。目前的研究顯示,miR-150-5p在多種癌癥中表達失調,調控癌癥進展,如Chen等[14]報道,miR-150-5p在體內外均能抑制結直腸癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成;Dai等[15]發(fā)現(xiàn),miR-150-5p過表達可有效抑制非細胞細胞肺癌球形腫瘤的形成和異種移植瘤的復發(fā);Yang等[16]研究表明,miR-150-5p可抑制黑色素瘤細胞的生長、轉移和糖酵解,調控癌癥發(fā)生。本研究結果證實,miR-150-5p在口腔鱗癌組織和細胞中表達降低,與患者較差的總生存率有關;此外,體外過表達miR-150-5p明顯抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。這一結果與Li等[12]研究結果一致。說明miR-150-5p在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌作用。

目前,miRNA與靶mRNA的3’UTR互補結合,導致mRNA降解或翻譯受阻,是其調控癌細胞生物學行為的經典方式。因此,本研究進一步利用在線數(shù)據(jù)庫TargetScan分析miR-150-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-150-5p與胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白2(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2,IGF2BP2)的3’UTR區(qū)具有互補結合位點,雙熒光素酶實驗證實miR-150-5p能夠與IGF2BP2靶向結合。IGF2BP2是一種腫瘤相關抗原蛋白,其表達在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[17,18]。如IGF2BP2在肝細胞癌中高表達,被證實可促進癌細胞的體內外增殖[19];IGF2BP2在胰腺癌中上調預示患者總生存期縮短,其過表達可通過激活PI3K/Akt信號通路促進胰腺癌細胞生長[20]。口腔鱗癌相關研究表明,IGF2BP2高表達與口腔鱗癌患者較差的總生存率相關,在IGF2BP2高表達的組織樣本中,細胞凋亡、腫瘤和免疫相關通路顯著富集,且其蛋白表達水平與患者淋巴結轉移和癌癥分期顯著相關[21-23];提示IGF2BP2可能是口腔鱗癌的一個潛在治療靶點。本研究結果顯示,在口腔鱗癌細胞中敲低IGF2BP2有效抑制了癌細胞的增殖、遷移和侵襲,使細胞凋亡增加;其作用與過表達miR-150-5p一致。此外,功能拯救實驗證實,過表達IGF2BP2能夠減弱miR-150-5p對口腔鱗癌細胞惡性行為的抑制作用,提示miR-150-5p可通過靶向抑制IGF2BP2發(fā)揮其抑癌作用。

綜上所述,本研究證實口腔鱗癌組織和細胞中miR-150-5p高表達,IGF2BP2低表達;過表達miR-150-5p可能通過靶向抑制IGF2BP2基因表達,抑制口腔鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進細胞凋亡。本研究結果揭示了miR-150-5p/IGF2BP2軸在口腔鱗癌中的調控機制,為其作為口腔鱗癌的治療靶點提供了實驗參考。