肝清寧調控肝癌MHCC97細胞及腫瘤惡化的影響

湯曉青 郭璽 萬焱 王潔 徐斌 陳瑾 張潔 付海艷 羅煜

調查顯示,全球新增約84萬例肝癌病例和78萬例肝癌死亡病例,僅中國就占病例和死亡總數的50%左右[1,2]。盡管我國肝癌的發病率和死亡率呈顯著下降趨勢,但龐大的人口基數和快速的人口增長,仍導致新發肝癌患者大量增加[3]。在臨床中首選手術治療,結合放化療可抑制癌癥惡化、延長患者生存期,但因耐藥性的產生使療效不十分滿意。中國傳統醫學中的中藥包括動物中藥、植物中藥和礦物質中藥,均為天然產物,以綠色健康低毒著稱[4]。復方中藥肝清寧是一種我國的民間藥方,君藥土鱉蟲、水蛭,臣藥三七、甲珠、雞內金等均參與肝癌的治療[5,6],但是該方劑的臨床效果研究筆者所見甚少。本研究旨在探討肝清寧對肝癌細胞、腫瘤惡化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:5只4周齡的SPF裸鼠(18±1)g購自湖南斯萊克景達實驗動物公司。實驗動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004。(2)試劑、耗材:人肝癌細胞MHCC97購自美國ATCC;DMEM培養基購自美國;復方中藥肝清寧(土鱉蟲30 g、水蛭20 g、三七30 g、甲珠20 g、雞內金30 g、紫河車45 g、黨參30 g、黃芪30 g、茯苓30 g、白術30 g、郁金30 g)由我院藥劑室制備。5氟尿嘧啶(5-Fu HPLC>99%,貨號:51-21-8)購自西安齊岳生物科技有限公司;CCK8試劑盒購自日本同仁;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天;Cleaved caspase-3、Cleaved PARP、MMP-3、MMP-9抗體購自上海艾博抗;Transwell小室購自美國corning;ECL發光試劑盒購自上海翌圣生物科技公司;Gallios流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特。

1.2 方法

1.2.1 MHCC97細胞的培養:10%胎牛血清+1%青鏈霉素的DMEM培養液,在37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細胞培養箱中培養48 h,更換新培養基,傳代培養。

1.2.2 分組:正常培養的MHCC97細胞為對照組。20、40、80 μg/ml的肝清寧培養的細胞為低濃度組、肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組。肝清寧藥液的制備:根據藥物在人體內的血藥濃度初步推算在細胞中的藥物濃度,并在此濃度上下波動設置濃度梯度。用臨床用量除以體重估計的血漿容量,算出藥物全部吸收時可達到的血濃度,以此為基礎做一個濃度梯度。通過預實驗-細胞毒性實驗,篩選出最適濃度40 μmol/L,取1/2和2倍做為低濃度、高濃度。將所需藥物充分粉碎,過200目篩,干燥保存。先制備80 μg/ml的高濃度藥液,再倍比稀釋為中濃度、低濃度藥液,使用前用0.22 μm的濾膜過濾除菌。5-Fu(150 μg/ml)處理MHCC97細胞,作為陽性對照組設為5-Fu組。

1.2.3 細胞增殖能力的檢測:①按照CCK8試劑盒檢測的說明要求操作:收集各組細胞,分裝置96孔板,每孔1 000個細胞,置于細胞培養箱中培養24、48、72 h,然后加入10 μl CCK8反應液,37℃孵育20 min后在450 nm波長下檢測吸光度。細胞存活率(%)=(OD490實驗組-OD490對照組)/OD490對照組×100%。②克隆形成實驗:將細胞制備成單細胞懸液,把細胞均勻接種于培養皿(2 000個細胞),培養2周后會有肉眼可見的小白點。用甲醇固定、結晶紫染色,計算克隆形成數。

1.2.4 細胞凋亡能力的檢測:①Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞的凋亡能力:按照試劑盒說明書要求操作,用冷PBS沖洗細胞,重懸,加500 μl結合緩沖液懸浮。加入Annexin V-FITC、PI染料各5 μl,避光孵育20 min,流式細胞術檢測分析細胞的凋亡情況。總凋亡率(%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。②WB實驗檢測凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3、Cleaved PARP的表達:RIPA、超聲裂解充分裂解細胞,提取蛋白,進行定量變性后,取上清用于蛋白電泳。先準備下層的分離膠,灌膠,擦去氣泡,再準備上層的濃縮膠,凝固后,加樣。先穩流,45 A電泳1 h左右,條帶下緣至分離膠上緣,再進行穩壓電泳,電壓調至220 V,約2 h左右,條帶至分離膠下緣1 cm,關閉電泳儀。將膠上的蛋白用轉膜儀濕轉至PVDF膜,并用封閉液37℃封閉處理2 h。結束后將膜浸入一抗稀釋液(1 500倍稀釋的兔抗人Cleaved caspase-3、Cleaved PARP多抗)中,37℃孵育4 h,洗膜后轉移至稀釋的二抗溶液(500倍稀釋的山羊抗兔二抗)中,37℃孵育2 h。結束后用ECL發光液顯影、曝光。Image J分析蛋白灰度。

1.2.5 細胞遷移侵襲能力的檢測: ①Transwell實驗檢測細胞遷移侵襲能力:對待測細胞饑餓處理24 h,取200 μl約10 00個細胞均勻涂抹于上室表面,下室加入600 μl含血清的培養液,培養24 h。取出小室上膜,固定,染色,顯微鏡下觀察計數,拍照。細胞侵襲能力檢測使用含有基質膠的Transwell小室。②劃痕實驗檢測細胞侵襲能力:先對細胞饑餓處理24 h,準備劃線的培養板。接種相同量的細胞,并用牙簽劃痕,鏡下記錄劃痕的寬度(mm)。培養24 h后,取出鏡下觀察,劃痕的寬度(mm)。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。③Western blot實驗檢測細胞MMP-3、MMP-9蛋白表達:按照1.4中的WB實驗流程操作。所用一抗為2000倍稀釋的兔抗人MMP-3、MMP-9多抗,二抗為500倍稀釋的山羊抗兔二抗。

1.2.6 腫瘤的異種移植:將5只裸鼠,右前肢皮下接種0.5 ml約1 000個細胞,足料足水飼養。分別設為對照組、肝清寧低濃度組、肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組、5-Fu組。次日,肝清寧(55.36、27.68、13.84 g生藥/kg)灌胃給藥,1次/d,連續4周。對照組同時灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,5-Fu組肌內注射30 μg/kg 5-Fu,1次/d,連續5 d,之后劑量減半,隔日1次。4周后,游標卡尺測量腫瘤的最長直徑、最短直徑(mm),斷頸法處死裸鼠,剝離瘤子,稱重(g)。

2 結果

2.1 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞存活率的影響 與對照組比較,肝清寧(低、中、高)濃度組細胞在24 、48、72 h的存活率均顯著降低,細胞的克隆形成量顯著降低(P<0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組細胞在24 、48、72 h的存活率和克隆形成量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞存活率的影響

2.2 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞凋亡率的影響 與對照組比較,肝清寧(低、中、高)濃度組細胞凋亡率均顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組細胞凋亡率均顯著升高(P<0.05),差異有統計學意義。見圖1,表2。

圖1 流式細胞術檢測肝癌MHCC97細胞凋亡

表2 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞凋亡率的影響 n=9,

2.3 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞凋亡通路蛋白表達的影響 與對照組相比,肝清寧(低、中、高)濃度組細胞Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的蛋白表達量均顯著升高(P<0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組細胞Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)。見圖2,表3。

圖2 Western blot檢測肝癌MHCC97細胞中Cleaved caspase-3和Cleaved PARP表達

表3 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞凋亡率的影響

2.4 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞遷移和侵襲和影響 與對照組相比,肝清寧(低、中、高)濃度組細胞遷移數、侵襲數和劃痕愈合率均顯著降低(P<

0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組細胞遷移數、侵襲數和劃痕愈合率均顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞基質金屬蛋白的影響

2.5 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞基質金屬蛋白的影響 與對照組相比,肝清寧(低、中、高)濃度組細胞MMP-3、MMP-9蛋白表達均顯著降低(P<0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組細胞MMP-3、MMP-9蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 Western blot檢測肝癌MHCC97細胞中MMP-3和MMP-9表達

表5 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞基質金屬蛋白的影響 n=9,wt%,

2.6 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞移植瘤的影響 與對照組比較,肝清寧(低、中、高)濃度組裸鼠移植瘤質量和體積均顯著降低(P<0.05);與肝清寧低濃度組比較,肝清寧中濃度組、肝清寧高濃度組裸鼠移植瘤質量和體積均顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 不同濃度肝清寧對肝癌MHCC97細胞移植瘤的影響

3 討論

土鱉蟲、水蛭、三七等均在腫瘤的惡化進程中均具有抑制作用[7]。土鱉蟲性寒、微毒,中醫認為以毒攻毒可達到抗癌的作用,通過阻斷癌細胞G2/M期而抑制其增殖,促進其凋亡,發揮抗癌功效,此外還在體內促進腫瘤組織中細胞的凋亡,抑制腫瘤的生長,甚至土鱉蟲醇提物還抑制肝癌細胞的增殖,促進其凋亡,展現抗腫瘤作用[8]。有研究稱,水蛭含藥血清具有明顯的抑制胰腺癌細胞增殖、遷移侵襲的作用,產生這種作用與下調VEGF的含量有關[9],且水蛭提取物以劑量依賴性方式抑制肝癌細胞的增殖,誘導肝癌細胞凋亡[10]。而土鱉蟲、水蛭是肝清寧的主要組成成分。三七作為肝清寧的主要成分之一,其在肝清寧抗肝癌中的作用也不可小覷[11]。

趙凱麗[12]研究報道,復方肝清寧給藥后,明顯的抑制了小鼠腫瘤的體積和質量,并且腫瘤生長抑制的程度與藥物濃度呈正相關性。本研究結果顯示,不同濃度的肝清寧可抑制肝癌細胞增殖、遷移侵襲,促進癌細胞的凋亡,并且上調了Cleaved caspase-3、Cleaved PARP,下調了MMP-3、MMP-9,該藥的最適濃度為肝清寧中劑量濃度40 μg/ml。除此之外,為了進一步驗證肝清寧對肝癌的抑制作用,通過異種移植裸鼠成瘤實驗發現,肝清寧明顯的抑制了腫瘤的生長,再次說明了肝清寧在肝癌中的抑癌效果。

綜上所述,肝清寧抑制肝癌細胞增殖、遷移侵襲,促進癌細胞凋亡,抑制腫瘤的生長,為肝清寧在肝癌治療中的臨床應用奠定實驗基礎。