E-cadherin基因啟動子區(qū)高甲基化與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

左衛(wèi)微 馬國明 王愛芹 薛書霞

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖道系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率僅次于宮頸癌及內(nèi)膜癌,死亡率占婦科惡性腫瘤之首。2015年我國卵巢癌新發(fā)病例5.21萬,死亡2.25萬[1]。由于其發(fā)病隱匿,早期沒有典型癥狀,就診時70%患者已為晚期,伴有盆腹腔轉(zhuǎn)移,進(jìn)展期患者的5年生存率僅為30%～40%[2]。目前,臨床上治療卵巢癌以手術(shù)聯(lián)合鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療為主,但晚期卵巢癌特別是伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者已失去最佳治療時機,即使手術(shù),也易復(fù)發(fā)。因此,尋找有效預(yù)防和抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的分子靶點是臨床治療卵巢癌的關(guān)鍵所在。E-鈣粘蛋白(E-cadherin/CDH1)作為Ca2+依賴性的細(xì)胞粘附分子,是一種廣泛分布于成熟上皮組織中的跨膜糖蛋白,它在維持上皮細(xì)胞完整性、調(diào)節(jié)細(xì)胞運動及介導(dǎo)細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附反應(yīng)等方面起著重要作用。目前認(rèn)為E-cadherin可能是一種抑癌基因,其活性降低或失活可導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力下降,癌細(xì)胞容易從腫瘤原發(fā)灶上脫落,從而發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在多種實體腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),如大腸癌[4]、乳腺癌[5]、食管癌[6]、非小細(xì)胞肺癌[7]等。Yu等[8]同樣表明E-cadherin在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織,且其表達(dá)水平與腫瘤的分期、淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。DNA甲基化在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用,基因啟動子區(qū)的高甲基化可抑制基因的轉(zhuǎn)錄[9]。本研究將檢測卵巢癌組織及正常卵巢組織中E-cadherin基因啟動子的甲基化狀態(tài)及其mRNA的表達(dá)情況,探討相關(guān)性及與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2016年1月至2019年6月于唐山市人民醫(yī)院婦科住院行手術(shù)治療卵巢癌患者的卵巢癌組織標(biāo)本48例。所有患者行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù),術(shù)前未接受新輔助化療,大體標(biāo)本術(shù)后經(jīng)病理證實為上皮性卵巢癌。患者年齡28～73歲,平均(53.6±9.7)歲;組織學(xué)類型:漿液性腺癌34例,子宮內(nèi)膜樣癌9例,黏液性腺癌5例;組織分級:1 ～ 2級25例,3級23例;FIGO分期:Ⅰ期9例,Ⅱ期7例,Ⅲ期27例,Ⅳ期5例。對照組選取同一時期因子宮肌瘤或?qū)m頸癌行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織48例,其中子宮肌瘤患者29例,宮頸癌患者19例;年齡41～72歲,平均(54.2±7.8)歲。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。對照組術(shù)中證實無卵巢腫瘤,術(shù)后病理診斷為正常卵巢。組織標(biāo)本均在離體后30 min內(nèi)收集,迅速放入裝有1 ml RNAlater液的凍存管里并浸泡,于4℃冰箱里過夜后轉(zhuǎn)置于-20℃冰箱里低溫保存?zhèn)溆谩?biāo)本和資料收集均由患者本人知情同意,并獲得唐山市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司);PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根生化科技公司);QuantinovaTMSYBR?green pcr Kit(上海凱杰生物技術(shù)有限公司);7500 型熒光定量PCR儀(美國ABI公司);PCR引物(上海生工生物工程有限公司);DNA提取試劑盒(北京天根生化科技公司);EZ DNA Methylation-Gold kit試劑盒(美國Zymo Research公司);Go Taq?Green Master Mix (美國Promega公司)。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本總RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR):應(yīng)用TRIzol試劑盒抽提組織標(biāo)本中總RNA,檢測RNA濃度及純度,OD260/OD280值位于1.8～2.0。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒按說明書將5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并于-20℃冰箱保存,用于后續(xù)qPCR擴增。應(yīng)用Quanti NovaTMSYBR?Green PCR試劑盒進(jìn)行qPCR擴增反應(yīng),反應(yīng)體系為:Green Master Mix 10 μl、模板cDNA 2.0 μl、上游引物1.2 μl、下游引物1.2 μl、Rox 0.1 μl、最后加ddH2O至20 μl;反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;然后進(jìn)行35個循環(huán)(95℃變性45 s、58℃退火45 s、72℃延伸50 s);最后進(jìn)行95℃變性15 s、58℃退火60 s、95℃延伸30 s。引物序列:目的基因E-cadherin上游引物 5’-AGTGCCAACTGGACCATTCA-3’、下游引物5’-TCTTTGACCACCGCTCTCCT-3’;內(nèi)參GAPDH上游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。每個樣本的目的基因E-cadherin和內(nèi)參GAPDH分別進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),均設(shè)3個復(fù)孔,得到擴增曲線和溶解曲線。采用2-ΔΔCT法計算獲得E-cadherin基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.2 提取組織DNA、亞硫酸氫鹽修飾及甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP):應(yīng)用DNA提取試劑盒按照說明書操作提取卵巢癌組織及正常卵巢組織中的DNA分子,分光光度計檢測DNA分子的濃度和純度。應(yīng)用EZ DNA Methylation-Gold kit試劑盒并根據(jù)說明書操作將提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。MSP基本原理:DNA分子經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后,未發(fā)生甲基化的CG二核苷酸的胞嘧啶將脫去氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?而已發(fā)生甲基化的CG二核苷酸的胞嘧啶不發(fā)生脫氨基反應(yīng),仍為胞嘧啶,針對這種差異分別設(shè)計甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴增,即可區(qū)分DNA分子上CG二核苷酸的胞嘧啶是否發(fā)生甲基化。甲基化及非甲基化特異性引物通過MethPrimer軟件進(jìn)行設(shè)計,由上海生工合成。E-cadherin甲基化引物:上游引物5’-GGTGAATTTTTAGTTAATTAGCGGTAC-3’,下游引物5’-CATAACTAACCGAAAACGCCG-3’;E-cadherin非甲基化引物:上游引物5’-GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA-3’,下游引物5’-CCCATAACTAACCAAAAACACCA-3’。將亞硫酸氫鹽修飾的每個組織DNA標(biāo)本進(jìn)行2次PCR擴增(一次應(yīng)用E-cadherin甲基化引物擴增;另一次應(yīng)用E-cadherin非甲基化引物擴增),反應(yīng)體系為20 μl:Go Taq?Green Master Mix 10 μl、亞硫酸氫鹽修飾的模板DNA 1 μl、上下游引物各0.5 μl、最后加DEPC-水至20 μl;反應(yīng)條件設(shè)定:95℃預(yù)變性5 min;然后35個循環(huán)95℃變性45 s、58℃退火45 s、72℃延伸50 s;最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,凝膠成像儀成像并保存。結(jié)果判定:E-cadherin甲基化特異引物擴出目的條帶,而非甲基化引物未擴出目的條帶者為完全甲基化;由E-cadherin非甲基化引物擴出目的條帶,而甲基化引物無目的條帶者為非甲基化;甲基化引物和非甲基化引物均擴增出目的條帶者為部分甲基化,也記為E-cadherin甲基化陽性。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的甲基化和mRNA表達(dá)情況 病例組48例卵巢癌組織標(biāo)本中,有19例(39.6%)組織標(biāo)本檢測到E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化陽性;而48例正常卵巢組織中,僅有8例(16.7%)組織標(biāo)本檢測到E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化陽性,2組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2= 6.235,P=0.013)。E-cadherin基因mRNA在卵巢癌組織中的平均表達(dá)量低于正常卵巢組織(t=8.377,P<0.001)。見表1、2。

表1 卵巢癌和正常卵巢組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化情況 n=48,例(%)

表2 卵巢癌和正常卵巢組織中E-cadherin基因mRNA表達(dá)水平 n=48,

2.2 E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化陽性和甲基化陰性卵巢癌組織中E-cadherin基因mRNA的表達(dá)情況 E-cadherin基因mRNA在甲基化陽性卵巢癌組織中的平均表達(dá)量低于甲基化陰性卵巢癌組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.931,P=0.005)。見表3。

表3 E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化陽性和陰性卵巢癌組織中E-cadherin基因mRNA表達(dá)水平

2.3 E-cadherin基因甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征的關(guān)系 卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與卵巢癌患者的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、組織學(xué)分級、腫瘤病理類型、手術(shù)殘余病灶大小等不相關(guān)(P> 0.05)。卵巢癌組織中E-cadherin基因mRNA的表達(dá)量同樣與卵巢癌患者的FIGO分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 E-cadherin基因甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

卵巢癌是一種常見婦科惡性腫瘤,其死亡率位居婦科惡性腫瘤之首,嚴(yán)重威脅女性的健康。卵巢癌具有極強的侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,這造成其高的致死率。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié),這與細(xì)胞間黏附能力降低密切相關(guān)。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子,其表達(dá)下降可增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[10]。本研究比較了卵巢癌組織和正常卵巢組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)情況,我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化陽性率顯著高于正常卵巢組織,其mRNA表達(dá)量顯著低于正常卵巢組織,且卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)水平與卵巢癌患者的FIGO分期及淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。

E-cadherin屬于I型跨膜糖蛋白,編碼該蛋白的基因位于16q22.1,分子量為120 kU,包括16個外顯子、15個內(nèi)含子。E-cadherin廣泛分布于上皮細(xì)胞表面,在細(xì)胞間相互連接中發(fā)揮關(guān)鍵作用,從而參與維持細(xì)胞形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)的完整性。E-cadherin表達(dá)下調(diào)可使正常上皮細(xì)胞的極性消失,呈現(xiàn)惡性變并具有轉(zhuǎn)移和侵襲的特性[11];在惡性腫瘤中,其表達(dá)下降可增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[12]。此外,研究表明,E-cadherin還可與細(xì)胞內(nèi)的β-catenin相結(jié)合,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)[13]。當(dāng)E-cadherin表達(dá)降低使得細(xì)胞內(nèi)與之結(jié)合的β-catenin游離,大量聚積胞內(nèi)并轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑是調(diào)控細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵通路,其異常活化與細(xì)胞侵襲、遷移能力增強密切相關(guān)。先前的許多研究表明,E-cadherin在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),下調(diào)的E-cadherin通過激活Wnt/β-catenin信號通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14-16]。Yu等[8]應(yīng)用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)E-cadherin在卵巢癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織。本研究結(jié)果與其一致,卵巢癌組織中E-cadherin基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織,且臨床病理參數(shù)分析顯示E-cadherin的表達(dá)水平與卵巢癌患者的FIGO分期分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性率顯著相關(guān),即E-cadherin的表達(dá)越低,患者FIGO分期越晚,越容易出現(xiàn)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移。這些表明E-cadherin表達(dá)下調(diào)可能增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力,在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

表觀遺傳學(xué)改變在調(diào)控基因表達(dá)方面起重要作用,它是在基因組堿基序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達(dá)發(fā)生改變[17]。DNA甲基化是最重要的表觀遺傳學(xué)修飾之一,即在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下,DNA分子上CG二核苷酸的胞嘧啶結(jié)合上一個CH3,形成5-CH3胞嘧啶。基因啟動子區(qū)發(fā)生異常甲基化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子無法與DNA分子上的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點結(jié)合,從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[18]。在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中,Zhang等[19]應(yīng)用去甲基化試劑“地西他濱”處理細(xì)胞后,E-cadherin基因mRNA表達(dá)明顯升高,且前列腺癌組織標(biāo)本中E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化水平與其mRNA表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)性。此外,Liu等[20]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化水平顯著高于正常癌旁組織,其甲基化狀態(tài)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。本研究檢測了卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化陽性率顯著高于正常卵巢組織,且卵巢癌組織中E-cadherin基因甲基化狀態(tài)與患者FIGO分期、淋巴轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化陽性的卵巢癌組織中E-cadherin基因mRNA表達(dá)水平顯著低于甲基化陰性的卵巢癌組織。這些結(jié)果表明卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)的高甲基化可能通過下調(diào)其表達(dá)水平,從而增加卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力,促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,卵巢癌組織中E-cadherin基因啟動子區(qū)的甲基化陽性率顯著高于正常卵巢組織,其mRNA表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織,E-cadherin基因啟動子區(qū)甲基化陽性的卵巢癌組織中其mRNA表達(dá)水平顯著低于其在甲基化陰性卵巢癌組織中的表達(dá),且E-cadherin基因甲基化狀態(tài)及其mRNA表達(dá)與卵巢癌患者的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。這表明E-cadherin基因啟動子區(qū)的高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)可能在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用,有可能成為卵巢癌分子診斷和治療的重要靶點。