基因編輯技術CRISPR-Cas9在畜禽改良領域的應用

房瑋 郭佳朋 王梓楨 連洋 王溪 樊國翔

(華北理工大學，河北 唐山 063200)

引言

隨著生活水平的提高，人們對畜禽肉蛋奶類的需求變得豐富多樣，而畜禽品質的改良也成了科研工作者面臨的重要問題之一。基因編輯技術是一種新興的生物技術，其可以精準地修改生物體的基因組，從而實現對生物體性狀的精準調控[1]。基因編輯技術的出現，為畜禽改良領域帶來了新的機遇和挑戰。畜禽改良是指通過人工選擇、人工繁殖等手段，改良畜禽的生產性能、品質特征和抗病能力等方面的遺傳性狀，以提高畜禽的經濟效益和社會效益[2]。基因編輯技術的應用，可以在畜禽改良中實現更加精準、高效、可控的遺傳改良，為畜禽產業的發展提供新的動力和支撐。

基因編輯技術CRISPR-Cas9是利用細菌天然的免疫系統中的CRISPR-Cas系統，通過特定的引物和酶，實現對目標基因的精準切割和編輯。CRISPR-Cas9技術具有操作簡便、效率高、精度高等優點，已經成為目前最為流行和廣泛應用的基因編輯技術之一。在畜禽改良中，CRISPR-Cas9技術已經被廣泛應用，取得了一系列重要的研究進展和應用成果[3]。

可以利用CRISPR-Cas9技術實現對畜禽的生長速度、肉質品質、抗病能力等方面的遺傳改良。這些遺傳改良可以提高畜禽的生產性能和品質特征，從而增強畜禽產業的競爭力和市場占有率[4]。

CRISPR/Cas9技術還可以用于畜禽的疾病防控。畜禽疾病是畜禽產業發展中的重要問題，其不僅會導致畜禽的生產性能下降，還會對人類的健康和生命安全造成威脅。可以用CRISPR-Cas9技術實現對畜禽抗病基因的精準編輯，從而提高畜禽的抗病能力和免疫力。這些抗病基因的編輯可以使畜禽更加健康、強壯，減少疾病發生的風險，從而提高畜禽產業的可持續發展能力[5]。

畜禽的基因資源是畜禽產業發展的重要基礎，包含了豐富的遺傳信息和生物多樣性。通過CRISPR-Cas9技術，可以實現對畜禽基因資源的精準保護和利用，從而促進畜禽產業的可持續發展和生態保護[6]。

綜上所述，基因編輯技術CRISPR-Cas9可以用于畜禽的遺傳改良、畜禽的疾病防控、畜禽的基因保護和遺傳資源的利用等目標[5，6]。因此，CRISPR/Cas9在畜禽改良方面的應用為畜禽產業的發展提供新的動力和支撐，具有廣泛的前景和重要的意義。

1 基因編輯技術的原理和方法

基因編輯技術是一種通過精確修改生物體的基因序列來改變其性狀的方法。目前常用的基因編輯技術包括鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄激活樣效應核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas9等[7]。其中，CRISPR-Cas9技術是目前最為廣泛應用的一種基因編輯技術，也是本文主要應用的基因編輯技術。

CRISPR-Cas9技術的原理是利用一種天然存在于細菌中的防御機制，即CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系統。該系統可以識別并剪切入侵細菌的病毒基因組，從而保護細菌免受病毒感染。CRISPR系統由一系列短重復序列和間隔序列組成，其中間隔序列中包含了來自病毒基因組的片段。這些片段可以被轉錄成RNA，與Cas蛋白結合形成復合物，從而識別并剪切與這些片段相匹配的DNA序列[8]。利用CRISPR-Cas9技術進行基因編輯的方法主要包括以下幾個步驟。

1.1 設計sgRNA

sgRNA是一種由CRISPR系統中的RNA和人工合成的RNA序列組成的復合物，用于指導Cas9蛋白識別并剪切目標DNA序列。sgRNA的設計需要考慮到目標基因的位置、長度和特異性等因素。

1.2 合成sgRNA和Cas9蛋白

sgRNA和Cas9蛋白可以通過化學合成或基因工程技術進行制備。合成后的sgRNA和Cas9蛋白可以通過轉染或電穿孔等方法導入到目標細胞中。

1.3 識別和剪切目標DNA序列

sgRNA和Cas9蛋白復合物可以識別并結合到目標DNA序列上，從而引導Cas9蛋白剪切目標DNA序列。剪切后的DNA序列可以通過非同源末端連接或同源重組等方式進行修復。

1.4 驗證編輯效果

編輯后的細胞可以通過PCR、測序等方法進行驗證，以確定編輯效果是否達到預期。

CRISPR/Cas9技術具有高效、精準、可重復性等優點，已經被廣泛應用于畜禽改良、疾病治療、基因功能研究等領域[5]。

2 基因編輯技術在畜禽改良中的應用

基因編輯技術CRISPR/Cas9已經被廣泛用于改良畜禽的性狀，如提高畜禽肉的產量和品質，提高畜禽抗病性，提高畜禽生長速度，提高蛋奶品質等方面。目前已經有許多研究報道了基因編輯技術在畜禽改良中的應用，見表1。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯技術在畜禽改良中的應用

2.1 豬

利用CRISPR-Cas9技術可以精準地編輯豬基因組中的抗病基因，提高豬對病原微生物的抵抗能力。如，Fuminori等利用CRISPR-Cas9技術編輯了豬基因組中的CD163基因，使其不再受到豬瘟病毒的感染，從而提高了豬的抗病能力[9]；肌抑素基因(MSTN)限制了豬骨骼肌的生長，利用CRISPR-Cas9技術將這種基因敲除后的豬(MSTN-KO)長出更大的骨骼肌，從而有更多的肉產量，除此之外MSTN-KO表型已在牛、山羊和綿羊中引入[10]；利用CRISPR-Cas9技術將NANOS2基因敲除后的公豬(NANOS2-KO)可以引入其它具有生殖細胞遺傳優勢公豬的基因，增強了這種豬的遺傳潛力[11]；利用CRISPR-Cas9技術還成功敲除豬的MHC系統，這種豬的器官可捐獻用于異種移植，并可用于免疫學研究[12]。

2.2 雞、鵪鶉

CRISPR/cas9可用于將雞細胞中chANP32A基因替換為增強禽類細胞中禽類聚合酶活性的huANP32A基因，使雞細胞中禽流感病毒增強的聚合酶活性降低，從而提高雞提供對禽流感的抗性。CRISPR/Cas9還可用在雞的基因組中引入類似rig-i的抗病基因，培育得到對禽流感具有更高抗性的雞，并且這種方法對多種禽類都適用[13]。

SCRISPR-cas9介導的鵪鶉MLPH基因敲除是將CRISPR-Cas9腺病毒載體直接注入鵪鶉胚皮，之后從鵪鶉嵌合體獲得后代。經檢驗發現這些嵌合體后代MLPH基因有突變[14]；可以利用腺病毒CRISPR-Cas9系統介導的方法使靶向肌抑素(MSTN)基因在鵪鶉體內產生突變。與雜合突變和野生型鵪鶉相比，MSTN純合突變型鵪鶉的體重和肌肉質量顯著增加，脂肪百分比下降，心臟質量增加[15]。

2.3 牛、羊

利用CRISPR-Cas9將NRAMP1基因被插入牛的基因組時，牛對牛分枝桿菌引起的牛結核病產生了耐藥性[16]。利用CRISPR-Cas9技術成功替換了牛身上的異亮氨酰tRNA合成酶基因中的一個單個突變核苷酸，使之重新變回正常的異亮氨酰tRNA合成酶[17]。

綿羊的毛色是生產過程中必不可少的性狀，可以利用CRISPR-Cas9基因修飾技術，獲得不同顏色的綿羊被毛，毛色物理組成的差異很大程度上是基于CRISPR-Cas9的改變、突變和復制[18]；利用CRISPR-Cas9技術，通過在綿羊組織基因的非特異性堿性磷酸酶的單點插入，成功地制作了一種罕見的人類骨骼疾病——磷酸酶缺乏癥的大型動物模板[19]。這些轉基因綿羊完美地復制了人類的低磷癥，為長期研究低磷癥的發展和研究人類骨骼[20]的其他不尋常疾病都提供了一個新的領域；利用CRISPR-Cas9方法敲除綿羊的Myostatin基因，以改善綿羊的肌肉發育和生長。經檢驗與野生型綿羊相比，肌生成抑制素Myostatin基因缺失型綿羊的體重更高，這說明CRISPR-Cas9是一種利用基因敲除技術生產綿羊的有效方法[21]。CRISPR干預技術可在山羊的原代成纖維細胞中有效插入FGF，GDF8基因的單等位和雙等位KO基因，將這些單基因KO成纖維細胞用于SCNT過程，產生活著出生并具有FGF，GDF8雙等位變化的山羊[22]。CRISPR技術還被用來分析如硬脂酰輔酶A去飽和酶1的基因在山羊乳腺上皮細胞中的作用[23]。

3 CRISPR-Cas9技術的優勢及在畜禽改良領域的未來發展方向

基因編輯技術CRISPR-Cas9與傳統的基因改良方法相比具有許多優勢。CRISPR-Cas9可以實現精確的基因改良，避免了傳統基因改良方法中的隨機突變；CRISPR-Cas9可以快速地實現基因改良，縮短了基因改良的時間。但CRISPR-Cas9也存在一些局限性，如該系統會產生非常有害的脫靶效應，脫靶效應在隨機位點產生不利的突變，影響基因組修飾的精度，這引起了對安全性和有效性的擔憂，尤其是當畜禽被飼養用于肉和蛋生產時[24]。

總體來說，CRISPR-Cas9在畜禽改良領域的應用前景非常廣闊，未來可以廣泛應用于畜禽的改良。CRISPR-Cas9在提高各類畜禽產品產量和品質的同時也能提高畜禽自身抗病性等[25]；此外，CRISPR-Cas9還可以用于研究農業生物的基因功能和調控機制，為現代的大農業生產提供更多的科學依據和發展方向。