藜麥OSCA基因家族的鑒定及進化分析

李 鳳，曹慧芬，劉麗珍，董文姝，黃子娟，唐紀文

（1山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009；2山西大同大學(xué)設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，山西大同 037009）

鈣離子作為第二信使，在植物響應(yīng)逆境脅迫及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮重要作用。植物在遭受外界刺激后可通過Ca2+通道來調(diào)控胞內(nèi)Ca2+濃度，從而響應(yīng)逆境脅迫[1]。高滲性門控鈣滲透通道（hyperosmolality gated calcium-permeable channel，OSCA）是一種Ca2+非選擇性陽離子通道，被認為是一種高滲脅迫感受器，在植物感知外界滲透脅迫和激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[2]。OSCA 家族蛋白具有3 個保守結(jié)構(gòu)域，分別為Late exocytosis、Cytosolic domain of 10TM putative phosphate transporter 及Calcium-dependent channel，并具備多個跨膜結(jié)構(gòu)域[2]。研究表明，OSCA基因能明顯響應(yīng)逆境脅迫的誘導(dǎo)，該基因的表達能明顯提高植物的抗逆性[3-4]。

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.，2n=4x=36）為莧科藜屬植物，是一種原產(chǎn)于南美洲安第斯山地區(qū)的營養(yǎng)豐富的雙子葉假谷物[5]。藜麥被印加土著居民稱為“糧食之母”，營養(yǎng)價值很高，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織認定是現(xiàn)今唯一一種單體植物就能滿足人類所需全部營養(yǎng)需求的食物[6-8]。此外，藜麥對土壤鹽漬、干旱、霜凍等極端環(huán)境表現(xiàn)突出的抗性[6]。因此，聯(lián)合國大會將2013 年宣布為“國際藜麥年”[6]。為了推進藜麥產(chǎn)業(yè)，加速藜麥的遺傳改良，越來越多的科研人員投入到藜麥的研究中。目前藜麥的全基因組序列已經(jīng)測通[6]，為作物的遺傳改良及全球糧食安全奠定了基礎(chǔ)，也為藜麥的抗逆基因挖掘及機理解析提供了依據(jù)。

目前，OSCA已在多種植物中進行了鑒定，而在藜麥中的研究未見報道。本研究對藜麥OSCA基因家族成員進行全基因水平上進行鑒定及進化分析，為今后藜麥抗性基因的篩選及抗性機制解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藜麥OSCA基因家族成員的鑒定及序列特征分析

從TAIR 數(shù)據(jù)庫[9]中下載擬南芥的15個OSCA 的蛋白序列[1]，從Ρhytozome 數(shù)據(jù)庫[10]中下載藜麥的基因組數(shù)據(jù)。以擬南芥OSCA 的氨基酸序列作為探針（query），利用BLASTΡ 程序[11]搜索藜麥的基因組數(shù)據(jù)，之后利用NCBI 中的CDD 程序?qū)蜻x成員的蛋白結(jié)構(gòu)域進行鑒定，剔除不含完整結(jié)構(gòu)域的序列，所得的基因即為最終的OSCA成員。

利用Expasy 的ΡrotΡaram 工具[12]來計算藜麥OSCA 的蛋白長度、分子量、等電點、疏水性指數(shù)、脂肪族氨基酸含量等理化性質(zhì)。利用Softberry（http://www.softberry.com）中的ΡrotComp 9.0 程序?qū)见淥SCA蛋白的亞細胞定位進行預(yù)測。

1.2 藜麥OSCA基因家族的進化分析

利用Clustal W軟件[13]對擬南芥和藜麥的OSCA成員進行氨基酸序列聯(lián)配。利用MEGA7軟件[14]，采用鄰接法構(gòu)建進化樹。利用GSDS工具[15]對藜麥OSCA成員的基因結(jié)構(gòu)進行分析。

1.3 藜麥OSCA基因的染色體定位和基因重復(fù)事件分析

從藜麥基因組數(shù)據(jù)庫中搜索藜麥OSCA成員的染色體位置信息，之后依據(jù)前人的研究[16]對復(fù)制基因進行判定。利用KaKs_Calculator 工具得到的非同義替換率（Ka）與同義替換率（Ks）的比值（Ka/Ks）來分析環(huán)境選擇壓力[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥OSCA基因家族成員的分析

本研究在藜麥基因組中共鑒定出21 個OSCA成員，將其命名為CqOSCA1～21（表1）。通過對藜麥OSCA 的蛋白質(zhì)信息進行分析可知，蛋白長度最長的是CqOSCA5（838 aa），最短的是CqOSCA3（483 aa）；預(yù)測的蛋白分子量最高的是CqOSCA5（96 389.01 Da），最低的是CqOSCA3（55 563.76 Da）；等電點分布在5.71（CqOSCA11）～9.3（CqOSCA4）；脂肪族氨基酸指數(shù)最大的是CqOSCA21（108.82），最小的是CqOSCA13（92.33）；所有藜麥OSCA 均表現(xiàn)為疏水性，其中CqOSCA2 疏水性最高，為0.317。藜麥OSCA 均具有多個跨膜結(jié)構(gòu)域（3～11 個），亞細胞定位結(jié)果表明，多數(shù)藜麥OSCA 定位在質(zhì)膜上，僅有CqOSCA14蛋白定位在葉綠體上。

表1 藜麥OSCA家族成員信息

2.2 藜麥OSCA基因家族的進化分類

以擬南芥OSCA基因家族的進化分類作為依據(jù)，構(gòu)建藜麥OSCA基因家族的系統(tǒng)進化樹（圖1）。21個藜麥OSCA成員被劃分為4個亞家族，分別為Subfamily I、II、III和IV。各個亞家族所包含的成員數(shù)是不同的：Subfamily II成員數(shù)最多，有8 個CqOSCA，接著是Subfamily I（6個）和Subfamily III（5個），Subfamily IV的亞家族成員數(shù)最少，為2個。

圖1 藜麥和擬南芥OSCA基因家族的進化關(guān)系

2.3 藜麥OSCA基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

為進一步分析藜麥OSCA基因家族的進化關(guān)系，對該家族的內(nèi)含子-外顯子分布進行了鑒定（圖2）。首先，CqOSCA基因成員的內(nèi)含子數(shù)量范圍在0～11個。其中，Subfamily I 成員的內(nèi)含子數(shù)量為8～11個，Subfamily II 成員的內(nèi)含子數(shù)量為6～10 個，Subfamily III 成員的內(nèi)含子數(shù)量為3～7 個，Subfamily IV成員的內(nèi)含子數(shù)量為0～1個。同一亞家族的內(nèi)含子數(shù)量是接近的。其次，各個亞家族的內(nèi)含子序列長度是相似的，例如Subfamily II 成員的內(nèi)含子序列較長，而Subfamily IV 成員的內(nèi)含子序列較短，且CqOSCA10基因不含有內(nèi)含子。

圖2 藜麥OSCA基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)

2.4 藜麥OSCA基因家族的染色體定位及基因復(fù)制事件

根據(jù)藜麥的基因組信息，對21個CqOSCA基因進行染色體定位分析（表2），并對藜麥OSCA基因復(fù)制事件進行探究，來闡述該基因家族的擴增形式。如表3 所示，在藜麥中鑒定出5 次OSCA復(fù)制事件。分別為CqOSCA4/CqOSCA8（Subfamily I）、CqOSCA7/CqOSCA17（Subfamily II）、CqOSCA12/CqOSCA19（Subfamily II）、CqOSCA2/CqOSCA14（Subfamily III）、CqOSCA10/CqOSCA11（Subfamily IV）。每對復(fù)制基因的Ka 與Ks 的比值可以衡量基因復(fù)制后所經(jīng)歷的環(huán)境選擇壓力，在本研究中。4 對復(fù)制基因的Ka/Ks 值＜1，僅有1 對復(fù)制基因的Ka/Ks 值＞1。

表2 藜麥OSCA基因家族的染色體位置信息

表3 藜麥OSCA基因家族中復(fù)制基因的Ka/Ks分析

3 討論與結(jié)論

根據(jù)OSCA家族的進化關(guān)系做出的分類可以幫助我們更好地研究該基因家族，并有利于進行進一步的功能分析。到目前為止，OSCA家族的進化分析已在多種植物中進行了研究。本研究從藜麥中鑒定出21 個OSCA成員，通過進化分析將其劃分為4個亞家族。在擬南芥[1]、大豆[18]、煙草[19]、辣椒[20]等植物中，Subfamily I 的成員數(shù)最多，其次是Subfamily II，而在藜麥中，Subfamily II 成員的比例與其他植物相比增高，是成員數(shù)最多的亞家族，而Subfamily I 的OSCA成員比例有所降低。該結(jié)果表明在植物的進化過程中，基因的缺失和保留可能與一定的功能有關(guān)[21]。

基因的外顯子及內(nèi)含子動態(tài)可以反映該基因家族的進化過程[22]。本研究結(jié)果表明，藜麥各個亞家族OSCA基因結(jié)構(gòu)是高度保守的，這種保守與進化關(guān)系密切吻合。有研究表明，基因復(fù)制可能是物種進化的動力[23]。本研究在藜麥中分別發(fā)現(xiàn)了5 對復(fù)制基因且在各個亞家族中均有分布。Ka/Ks 值分析結(jié)果表明，在基因復(fù)制發(fā)生之后，有80%的OSCA復(fù)制基因經(jīng)歷了強烈的純化選擇作用，結(jié)果暗示其基因功能并沒有發(fā)生嚴重的分化[21]。

綜上所述，本研究對藜麥OSCA基因家族進行全基因水平上的鑒定、進化分類、基因結(jié)構(gòu)及基因復(fù)制分析，為今后藜麥OSCA家族分子進化機制的闡明及抗逆基因的篩選奠定基礎(chǔ)。