ABA在小麥幼胚培養中的應用研究

摘要 為提高小麥幼胚體細胞再生頻率，以豫麥49、豫麥18、蘭考906為試驗材料，研究不同濃度ABA對小麥幼胚離體培養特性和草酸鹽氧化酶活性的影響。結果表明，不同基因型間、ABA濃度間小麥幼胚愈傷組織誘導率、分化率和草酸鹽氧化酶活性差異均達到極顯著水平，基因型間以豫麥18最高，蘭考906最低；不同ABA濃度間以0.10 mg/ L 處理對幼胚愈傷組織形成和分化最為有利；不同濃度ABA條件下小麥幼胚胚性愈傷組織誘導率與草酸鹽氧化酶活性存在極顯著相關。

關鍵詞 小麥；幼胚；ABA；胚性愈傷組織；培養特性；草酸鹽氧化酶

中圖分類號 S512.1 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）06-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.006

Application of ABA in Immature Embryo Culture of Wheat

HE Sheng－lian

（Wheat Research Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract In order to improve the regeneration frequency of somatic cells of wheat immature embryo，the effects of different ABA concentrations on tissue culture of immature embryo callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were studied with Yumai 49，Yumai 18 and Lankao 906 as the research materials.Results showed that the differences of induction frequency of emryogenic callus and differentiation rates of callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were extremely significant different between different ABA concentrations or genotypes，which were the highest in Yumai 18 and the lowest in Lankao 906 among different genotypes.Treatment with 0.10 mg/L between different ABA concentrations was most beneficial for immature embryogenic callus formation and differentiation.Induction frequency and oxalate oxidase activities of immature emryogenic callus of wheat? was extremely significant between different ABA concentrations.

Key words Wheat;Immature embryo;ABA;Embryonic calli;Cultural characters;Oxalate oxidase

在小麥的各種外植體中，幼胚是再生植株最有效的外植體［1-7］，小麥幼胚誘導產生的再生體系具有多方面的應用價值。但是，這一體系的建立受到諸多因素的影響，如外源植物激素［6-11］、供體的基因型［6-7，9，11］、幼胚的發育成熟程度（胚齡）［12-16］及其他環境條件等［17-18］。

脫落酸在植物組織培養中的應用最早主要集中在雙子葉植物及模式植物胡蘿卜的體胚發生研究上。早期的研究認為，適當濃度的脫落酸可抑制不正常胚狀體的形成，防止胚狀體過早萌發［19］。但也有研究者發現，在胡蘿卜離體培養中使用0.1 μmol/L的脫落酸，胡蘿卜胚狀體有些不正常［20］。脫落酸在禾本科植物的組織和細胞培養中也有應用，張棟等［21-23］研究發現，適當濃度ABA對愈傷組織分化有利。于曉紅等［9］研究發現，在小麥幼胚進行離體培養時，脫落酸對晚期幼胚的胚性愈傷組織誘導有促進作用，在愈傷組織誘導培養過程中加入適量的脫落酸有助于胚性愈傷組織的形成。

在組織培養過程中，草酸鹽氧化酶通過催化產生過氧化氫促進細胞壁纖維素組成成分的交聯，加強初生細胞壁，限制細胞壁的膨脹，使細胞保持在一種致密的、非液泡狀態下， 從而促進胚性愈傷組織的形成［24］。Caliskan等［24-27］研究表明，小麥和燕麥種子萌發過程中，草酸鹽氧化酶催化所產生的過氧化氫參與了細胞壁纖維素組成成分的交聯，草酸鹽氧化酶通過參與細胞壁的重新構建，控制著細胞的生長發育進程。由此可見，草酸鹽氧化酶是胚性愈傷組織形成過程中的一個關鍵酶。鑒于此，筆者以冬小麥品種豫麥49 、豫麥18和蘭考906為試驗材料，通過研究不同濃度ABA 對小麥幼胚組織培養特性和草酸鹽氧化酶活性及其之間的關系，探討小麥幼胚高效再生體系建立的生理機制，以期為組織培養技術在小麥改良中應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗材料選用冬小麥品種豫麥18、豫麥49、蘭考906。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基。

誘導培養基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培養基（MS+ Gln 250 mg/L+蔗糖60 g/L+瓊脂8 g/L，pH= 5.8）。

繼代培養基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培養基中加入ABA（0、0.05、0.10、0.50 mg/L）。分化培養基：1/2 MS+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+蔗糖60 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。誘導及繼代條件為25 ℃、無光照。分化條件為25? ℃ 、光照16 h/d、光照度2 500 lx。

1.2.2 幼胚的選擇及培養。

開花期選擇生長一致的麥穗掛牌標記，于開花后13～14 d取標記麥穗帶回實驗室，置4 ℃冷藏保存待用，接種時剝出中部小穗下部第1、2位小花籽粒，經75%酒精消毒30 s和0.1%升汞消毒10～15 min，無菌水洗3～5次。在無菌條件下將幼胚剝出，盾片向上接在誘導培養基上，放入25 ℃培養箱培養。誘導培養21 d后的初始愈傷組織，在誘導培養基上繼代培養14 d后，一部分先后轉移到繼代培養基，再誘導培養12 d后統計胚性愈傷組織誘導率，然后轉入分化培養基，并于14 d后統計分化率；同時取另一部分胚性愈傷組織在液氮中處理30 s，然后保存于- 80? ℃冰箱，以備測定草酸鹽氧化酶活性。

1.2.3 草酸鹽氧化酶活性的測定。草酸鹽氧化酶活性的測定方法參照Lane等［24］方法。

1.3 統計方法 誘導出的愈傷組織，轉移至分化培養基之前，進行胚性愈傷組織誘導率統計，分化培養結束后統計分化率。

胚性愈傷誘導率（%）=（胚性愈傷組織塊數/愈傷組織總塊數）×100。

分化率（%）=（分化的愈傷組織塊數/接種在分化培養基上的愈傷組織塊數）× 100。

胚性愈傷組織誘導率、分化率和草酸鹽氧化酶活性采用Excel和SPSS 11.0進行統計分析

2 結果與分析

2.1 不同ABA對小麥幼胚組織培養特性的影響

通過在培養基中添加不同濃度ABA，分析其對幼胚組織培養的影響。結果表明，不同基因型間、ABA 濃度間胚性愈傷組織誘導率和分化率差異均達極顯著水平。由此可見，ABA在幼胚離體培養中有重要的調控作用，同時品種間效應也存在顯著差異。

2.2 不同基因型對小麥幼胚組織培養特性的影響

由表1可知，在試驗條件下，基因型間胚性愈傷組織誘導率和分化率均達到極顯著差異。誘導率以豫麥18最高，為74.2%；豫麥49次之，蘭考906最低，豫麥18胚性誘導率分別是豫麥49和蘭考906的1.24、1.41倍。分化率以豫麥18最高（72.1%），分別是豫麥49和蘭考906的1.25和1.44倍；豫麥49次之（57.9%），蘭考906最低。

2.3 ABA 濃度對小麥幼胚組織培養特性的影響

對不同濃度ABA誘導下幼胚胚性愈傷組織誘導率和分化率進行分析（表2），結果顯示在試驗的濃度范圍內隨ABA濃度的增加，3個品種胚性愈傷組織誘導率和分化率增加，之后由于濃度過高又下降，其中0.10? mg/L ABA胚性愈傷組織誘導率和分化率均較大。與不加ABA處理相比，0.05? mg/L濃度ABA處理均極顯著增加豫麥18胚性愈傷組織誘導率和分化率，而對豫麥49和蘭考906增加效應不顯著；0.10和0.50 mg/L ABA處理均顯著增加3個品種胚性愈傷組織誘導率和分化率，且差異均達到極顯著水平，其中0.50較0.10? mg/L濃度的ABA效應降低，但差異不顯著。從表2還可以看出，各濃度ABA培養下胚性愈傷組織誘導率和分化率排序均為豫麥18>豫麥49>蘭考906。

2.4 ABA濃度對草酸鹽氧化酶活性的影響 從表3可以看出，ABA濃度對不同基因型幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性均有顯著影響，在試驗的濃度范圍內，隨培養基中附加ABA濃度的提高，草酸鹽氧化酶活性先提高，當達到一定濃度之后又下降。

從表3還可以看出，當附加0.10 mg/L ABA時，3個基因型幼胚胚性愈傷組織的草酸鹽氧化酶活性均較高，且與其他濃度處理間均達極顯著差異；沒有附加ABA處理的草酸鹽氧化酶活性最低，且與其他濃度處理間差異均達顯著水平。豫麥49 附加0.05 mg/L ABA處理的草酸鹽氧化酶活性小于附加0.50 mg/L ABA處理，而豫麥18和蘭考906附加0.05? mg/L ABA處理大于附加0.50 mg/L ABA處理的草酸鹽氧化酶活性。

相關分析表明，不同ABA濃度處理的草酸鹽氧化酶活性與幼胚胚性愈傷組織誘導率間相關系數為0.961，相關性達極顯著水平。

3 結論與討論

于曉紅等［9］研究發現，ABA對幼胚的胚性愈傷組織誘導有促進作用，在愈傷組織誘導培養過程中，加入適量的脫落酸有助于胚性愈傷組織的形成。該試驗以適齡的幼胚為試驗材料進行離體培養，結果表明0.10 mg/L ABA能改進愈傷組織的生長狀態，獲得較多質量高、致密的愈傷組織，有助于胚性愈傷組織的形成，從而提高分化率。當ABA濃度進一步提高時，愈傷組織質量反而有不同程度下降。關于ABA調節小麥幼胚愈傷組織培養特性的機理值得進一步研究。

有關小麥組織培養過程中草酸鹽氧化酶活性及其調控的研究鮮有報道。該研究結果表明，小麥幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性受外源物質和基因型的影響，不同濃度ABA 對幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性有顯著影響，并且隨外源物質濃度的增加而增加，但濃度過量時反而會降低，以0.10 mg/L 濃度處理幼胚胚性愈傷組織草酸鹽氧化酶活性最高，且品種間的效應也存在顯著差異。小麥幼胚胚性愈傷組織誘導率與草酸鹽氧化酶活性之間分析表明，二者之間極顯著相關。Caliskan等［24-28］研究表明，草酸鹽氧化酶是胚性愈傷組織形成過程中的關鍵酶。因此，加強組織培養過程草酸鹽氧化酶的研究，通過外源物質的調控、基因型的選擇等因素促進幼胚形成愈傷組織過程中草酸鹽氧化酶基因的表達，將從生理機制上提高小麥幼胚體細胞再生的研究，促進組織培養技術在品種改良中的應用。

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基金項目 河南省農業科學院基礎性科研工作項目（2022JC01，2023JC01）;河南省農業科學院自主創新項目（2022ZC02）。

作者簡介 何盛蓮（ 1972—），女，河南商城人，研究員，碩士，從事小麥遺傳育種研究。

收稿日期 2022-05-05