基于核基因和微衛星的葉城沙蜥遺傳多樣性分析

謝慧　蔣羅雪　趙偉　祁玥　段嘉寶　李孟純　劉筱燁　李鈾

摘要 為了研究我國特有物種葉城沙蜥（Phrynocephalus axillaris）的遺傳多樣性，采用微衛星和核基因分子標記方法，對新疆7個地區所采集的96只葉城沙蜥進行了遺傳多樣性分析?；趯?個微衛星位點和核基因BDNF的PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用軟件進行分析，結果表明群體單倍型多樣性為0.707和平均核酸多樣性為0.003 14，觀察到的雜合度平均值和預期雜合度平均值分別為0.52和0.65，總Fst值為0.175，發現試驗研究所采集的葉城沙蜥群體存在明顯的遺傳差異及種群間存在較大的遺傳分化。綜合分析說明采集的葉城沙蜥群群體間遺傳交流水平低，存在較高程度的遺傳分化，但由于樣本較少仍需對葉城沙蜥種群遺傳特征進一步研究。補充和豐富了新疆部分地區葉城沙蜥的基礎遺傳數據，為后續合理利用及保護該地區內其他物種的種質資源奠定了基礎。

關鍵詞 葉城沙蜥；微衛星; 腦源性神經營養因子（BDNF）;遺傳;種群

中圖分類號 Q953 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2023）06-0081-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.021

Genetic Diversity Analysis of Phrynocephalus axillaris Based on Nuclear Gene and Microsatellite

XIE Hui1，JIANG Luo－xue1，ZHAO Wei2 et al

（1.Life Science and Engineering College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou，Gansu 730100;2.College of Life Sciences，Lanzhou University，Gansu Provincial Key Laboratory of Environmental Biomonitoring and Restoration，Lanzhou，Gansu 730030）

Abstract In order to study the genetic diversity of the endemic species Phrynocephalus axillaris in China，the genetic diversity of 96 P.axillaris collected from seven regions of Xinjiang was analyzed by microsatellite and nuclear gene molecular markers.Based on the PCR amplification and agarose gel electrophoresis detection of six microsatellite loci and nuclear gene BDNF，the software was used for analysis.The results showed that the haplotype diversity of the population was 0.707 and the average nucleic acid diversity was 0.003 14.The average observed heterozygosity and expected heterozygosity were 0.52 and 0.65，respectively，and the total Fst value was 0.175.It was found that there were obvious genetic differences and large genetic differentiation among the populations collected in the experiment.Comprehensive analysis showed that the level of genetic communication among the collected populations was low，and there was a high degree of genetic differentiation.However，due to the lack of samples，it is still necessary to further study the genetic characteristics of the population.This study supplemented and enriched the basic genetic data of P.axillaris in some regions of Xinjiang，and laid the foundation for the subsequent rational utilization and protection of the germplasm resources of other species in the region.

Key words Phrynocephalus axillaris;SSR;BDNF;Heredity;Populations

葉城沙蜥（Phrynocephalus axillaris）是鬣蜥科（Agamidae）沙蜥屬（Phrynocephalus）的爬行動物［1］，屬于我國特有的一種小型爬行動物，已被列入《世界自然保護聯盟》（IUCN）2010年瀕危物種紅色名錄。廣泛分布于我國甘肅、西藏、新疆天山山脈南部地區，包括塔里木盆地及周邊的吐魯番—哈密盆地和敦煌盆地［2］。棲息在戈壁荒漠或沙漠邊緣地帶以及固定沙丘的丘間平地，有少數植被覆蓋，垂直分布的海拔高度為65～1 500 m，在阿爾金山南麓甚至可達3 000 m左右［3］。利用線粒體基因對于葉城沙蜥種群遺傳結構的研究未得到很好的解析，有可能與其分化時間太短或不完全譜系分選有關［4-5］。而基于微衛星位點變異速率快、多態性高等特點，有望更全面地解析葉城沙蜥的種群遺傳結構［6］。

微衛星標記，又稱簡短串聯重復（short tandem repeats，STRs）或簡單序列重復（simple sequence repeats，SSRs），是一種基于DNA長度多態性的分子標記技術。微衛星DNA由于具有特異性的PCR擴增、多態信息容量（PIC）高、引物通用性好、突變率高、共顯性、符合孟德爾遺傳、易于檢測等優勢，已被廣泛應用于種群遺傳、譜系地理和親子鑒定等領域［7-11］。微衛星標記較線粒體基因更具豐富的多態性，也是野生動物遺傳學分析常用的分子標記之一，研究者可以利用分子標記研究種群的擴散模式，從而更有效地保護和管理野生動物。仲光啟等［12］篩選了在黑鸛上可擴增的18個微衛星位點并進行了遺傳特點分析，王萌等［13］探討了微衛星標記方法在大型貓科動物保護群遺傳學研究中的應用與挑戰，劉旭等［14］概述了微衛星技術在珍稀瀕危野生動物中的相關應用以及分子生物學手段在珍稀瀕危野生動物擴散生態學的研究情況。對于沙蜥屬的研究主要與環境氣候變化有關，有紅尾沙蜥超氧化物歧化酶適應高原的分子機制［15］、青海沙蜥遺傳和表型分化的環境相關性［16］、增溫對青海沙蜥繁殖生活史及后代適合度的影響［17-18］等。目前關于葉城沙蜥中的研究相對較少，主要在兩性異形和形態特征差異、線粒體和基于高通量測序微衛星特征分析［19］，而關于微衛星分析研究較少。該研究利用高質量的SSR標記評估96只葉城沙蜥的遺傳多樣性，解析不同群體遺傳結構，為葉城沙蜥及新疆地區的物種保護提供理論依據。該研究利用6個微衛星位點和1對核基因引物，分析了7個地理種群96個樣本的遺傳多樣性、遺傳分化和系統地理結構，對葉城沙蜥進行系統發育分析，補充和豐富新疆地區葉城沙蜥的基礎遺傳數據，為保護該地區內其他物種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗研究對象為新疆7個地區（且末、民豐、策勒、和田、皮山、葉城、喀什）采集的96只葉城沙蜥，將組織樣本均置于無水乙醇與生理鹽水（1∶1配比）組織保存液中，-20 ℃保存備用（表1）。

1.2 基因組DNA的提取

使用通用型基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA的提取，并用紅色熒光核酸染料染色的1.4%瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的完整性和濃度檢測，并于放置于-20 ℃冰柜保存備用。

1.3 引物篩選及PCR擴增

試驗隨機選取4只葉城沙蜥組織作為篩選階段的材料，根據已發表的沙蜥文獻中引物信息及重新設計的葉城引物進行篩選［6］，選出3對南疆沙蜥（Pvms33、Pvms39、Phr51）［20-21］和新設計的3對葉城沙蜥（PA11、PA36、PA37）微衛星引物（表2）。PCR反應體系為（12 μL）：5×buffer（Mg2+ free） 2.4 μL、5 U/μL Immolase DNA聚合酶0.06 μL、10 μmol/L熒光標記上游引物tag F（Fam、Ned、Vic、Pet）0.09 μL、10 μmol/L熒光標記下游引物tag R 0.09 μL、0.4 μmol/L Primers 2.4 μL、DNA模板2 μL、其余由dd H2O補足12 μL。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性10 min;92 ℃變性60 s，50 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，5個循環；92 ℃變性30 s，63 ℃退火90 s，72 ℃延伸60 s，20個循環;92 ℃變性15 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，40個循環;最后72 ℃延伸10 min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像儀上觀察結果。將成功擴增的合格PCR產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行毛細管電泳分析。

根據GenBank公布的葉城沙蜥核基因（腦源性神經營養因子，brain-derived neurotrophic factor，BDNF）部分序列（序列號為KJ363410），使用Geneious Prime 2022.0.1（www.geneious.com）進行引物設計，上游引物：BDNF-11F（5′-TGCATGAAAGCTGCCCCAAT-3′），下游引物BDNF-600R（5′-CTGGGTAGTTCGGCACTGAT-3′）。引物由艾科瑞生物（湖南）公司合成。使用設計的引物對葉城沙蜥樣本進行擴增。通過試驗，建立最佳PCR擴增體系（25 μL）：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR反應條件：94? ℃預變性3 min；94? ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72? ℃延伸1 min，共循環 35 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物經1.4%瓊脂糖凝膠電泳進行純度檢測。檢測合格的擴增產物由蘭州天啟基因生物科技有限公司進行測序。

1.4 數據分析

試驗中所得到微衛星數據用GeneMarker［22］對測序儀得到的原始數據進行基因分型分析。用GenAlex V 6.5［23］和Popgene32［24］軟件分析等位基因數（number of allele，Na）、有效等位基因數（effective number of allele，Ne）、觀測雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）、群體間Nei’s遺傳距離和遺傳相似度、群體內近交系數（population inbreeding coefficient，Fis）、群體間的遺傳分化指數（genetic differentiation index，Fst）、基因流（gene flow，Nm）、Shannon多樣性指數（I）及方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）。用Cervus3.0軟件［25］計算各位點的多態信息含量（Poly-morphism information content，PIC），并進行哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢驗。用MEGA X［26］軟件繪制基于群體間的Nei’s遺傳距離的UPGMA（unweighted pair－group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類樹。

試驗中所選取的核基因BDNF片段長度在550～650 bp，PCR產物測序方式為正反向。采用Geneious 2020.2.5（http：//www.geneious.com）處理測序結果原始ABI文件，經過人工校對后獲得96條葉城沙蜥BDNF基因樣本，序列長度為524 bp?；诤嘶駼DNF分析葉城沙蜥7個種群的遺傳多樣性，主要包括單倍型多樣性（haplotype diversity，h）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）。下載Genbank上已發表的紅原沙蜥（P.hongyuanensis）的BDNF全基因（序列號為AF497714.1）作為外群的物種序列。使用MEGA-X軟件［26］構建NJ（neighbor-joining）和ML（maximum likelihood）系統發育樹，進化樹Bootstrap置信值為重復抽樣1 000次。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

試驗篩選出6對多態性高且穩定的微衛星及1對核基因引物，進行后續遺傳多樣性分析。對選取微衛星引物和核基因引物（其目的條帶在500～750 bp）在96只樣本上進行PCR擴增（核基因有1樣本未成功擴增），采用凝膠電泳檢測，目的條帶符合預期大小且清晰，核基因序列未提交至Genbank，將成功擴增的產物送公司進行測序。以部分樣品在引物PA37和BDNF的電泳結果為例（圖1），電泳圖和測序結果一致，并且能準確讀取具體的片段大小。

2.2 遺傳多樣性分析

6對SSR引物對7個葉城沙蜥群體進行擴增，各位點的平均等位基因數（Na）和有效等位基因數（Ne）分別為5.452和3.585個，平均觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、無偏預期雜合度（uHe）、群內近郊系數（Fis）、群體間分化系數（Fst）和基因流（Nm）分別為0.515、0.650、0.734、0.082、0.175和3.473（表3）。7個葉城沙蜥群體的等位基因數存在一定差異，其中Na最多的為QM群體（7.000個），CL和KS群體較少（表4）。分析葉城沙蜥種群在微衛星位點的遺傳多樣性參數，就位點而言，可知PA11位點上的平均Na、Ne、I、He較高，最低的是在Phr51（表3）；就種群而言，QM最高，KS最低，在雜合度方面，QM表現出較高的雜合性且有最為豐富的遺傳多樣性（表4）。

基于核基因BDNF對葉城沙蜥7個種群的遺傳多樣性分析，主要包括單倍型多樣性和核苷酸多樣性（表1）。首先分析單倍型多樣性，95只蜥蜴中共定義14個單倍型，群體平均單倍型多樣性為0.523，群體單倍型多樣性范圍為0.345～0.806，其中策勒（CL）單倍型多樣性最高，為0.806；葉城（YC）最低，為0.345。在核酸多樣性方面，葉城沙蜥平均核苷酸多樣性為0.001 72，核苷酸多樣性范圍為0.001 04～0.002 66，種群內平均單倍型以策勒（CL）最高，為0.002 66，葉城（YC）最低，為0.001 04，表明葉城沙蜥整體遺傳多樣性為高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性模式。

2.2.1 基于微衛星標記的遺傳分化。

葉城沙蜥7個群體間的Nei’s遺傳相似度和遺傳距離見表5。7個群體間的遺傳距離介于0.283～0.728，Nei’s遺傳相似度介于0.483～0.753。YC和MF之間遺傳距離最短，KS和CL之間的遺傳距離最長。

基于群體間Nei’s遺傳距離的聚類樹結果（圖2），7個葉城沙蜥種群分為兩大類，第一大類包括PS和KS 2個種群，其他種群為第二大類。第二大類再分為3個亞類，第Ⅰ類包括QM，第Ⅱ類包括CL和HT，第Ⅲ類包括MF和YC。AMOVA分析結果顯示，7個群體內的遺傳變異占總體變異的62%。群體間的遺傳變異占38%，分子方差AMOVA數據表明的變異大部分存在于群體內，說明這7個群體之間遺傳分化較小。

2.2.2 BDNF基因葉城沙蜥的系統發育分析。

基于核基因NJ系統發育分析，由圖3a可知，95個葉城沙蜥群體樣本均在同一大分支，同時KS、YC和PS聚在同一枝上。紅原沙蜥作為外群，獨立于另一分支上?；诤嘶蚪ǔ傻腗L進化樹，通過計算找到此次最大似然法構建進化樹的最佳模型為Kimura 2-paprameter model+Gamma Distributed，由圖3b可知，95個葉城沙蜥群體樣本均在同一大分支，同時KS、YC和PS聚在同一枝上，而MF、CL、HT和QM分別聚在兩支上。紅原沙蜥作為外群，獨立于另一分支上，結果基本一致。

3 討論

3.1 7個葉城沙蜥群體遺傳多樣性

遺傳多樣性研究是生物多樣性研究的重要組成部分，是生物進化和物種分化的基礎，研究物種遺傳多樣性對于評估物種資源狀況及在制定野生物種資源保護策略等方面具有重要意義［27］。等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度和多態信息含量等參數均反映群體遺傳基礎多樣性水平，其值越大，說明基因豐富度越高、生物對環境的適應能力越強。趙丹等［28］利用微衛星標記對我國胎生蜥蜴的3個種群的18只母本和67只子代進行遺傳多樣性分析，檢測到各種群母本和子代的觀測等位基因數在3.90～8.13。駱爽［29］基于微衛星對西藏高原的80個紅尾沙蜥和34個西藏沙蜥樣本進行多樣性分析，分別檢測出44和42個等位基因，平均觀測雜合度分別為0.360 7和0.399 6。該研究利用6對微衛星分子標記對7個葉城沙蜥群體進行遺傳多樣性分析，發現平均觀測雜合度、平均期望雜合度分別為0.515和0.650。哈迪-溫伯格平衡檢驗可以作為衡量群體遺傳結構的標準，該研究中，各個群體偏離HWE平衡，雜合體缺失和無效等位基因的存在是各個群體顯著偏離HWE平衡的原因。

該研究的7個葉城沙蜥種群在6個所用的微衛星位點上檢測到的平均Na/Ne值大于1，檢測到的平均等位基因數高于平均有效等位基因數，說明等位基因分布不勻，比值較大可能是由近交的原因及樣本數量不夠導致的。衡量群體遺傳變異的一個重要參數就是基因雜合度，一般期望雜合度（He）越高說明群體的遺傳變異越大；觀測雜合度（Ho）越接近期望雜合度（He），說明群體受外來因素影響越小，處于遺傳平衡狀態。而基于雜合度計算的近交系數（Fis）可以反映出群體內部的近交程度，它的數值大小反映出了群體中雜合子的缺失或者過剩程度，該研究中表明葉城沙蜥群體間存在一定程度的基因流，這也可以解釋基于BDNF構建的NJ和ML進化樹中，葉城沙蜥的各種群沒有完全獨立于一支的原因。

核基因在系統發育、生物地理等方面研究的巨大潛力逐漸被發現，由于核基因進化速率相對較慢，能夠反映更豐富的生物學信息，因此選擇BDNF基因作為研究葉城沙蜥種群進化的分子標記，能夠得到更豐富的結果?；贐DNF基因采用鄰接法（NJ）和最大似然法（ML）構建的2種進化樹結果幾乎一致，通過分析可知，在葉城沙蜥種群中，7個地區共計95個樣本均在1大分支上，喀什地區與同市的葉城和皮山的葉城沙蜥親緣關系最近，且末、民豐、策勒和部分和田地區的葉城沙蜥群體在同一大支，與基于遺傳距離構建的UPGMA圖大致一致，但其之間是否存在基因交流的個例無法確定，有待進一步研究。

3.2 葉城沙蜥群體遺傳分化和遺傳結構

遺傳分化參數Fst最大值為1表明兩個群體完全分化，最小值為0表明群體間無分化，在實際研究中，Fst在0～0.05時，表明物種群體間的遺傳分化水平很低，可以不做考慮；在0.05～0.15時，表明群體間的遺傳分化水平處于中等程度；在0.15～0.25時群體間存在較大的遺傳分化；0.25以上時群體間就存在很大的遺傳分化［30］。該研究揭示的7個葉城沙蜥群體間遺傳分化指數Fst為0.175，分子方差AMOVA數據表明38%的變異存在于群體間，62%的變異存在于群體內，表明群體間存在中等偏高程度的遺傳分化。

4 結論

研究使用多重熒光PCR及瓊脂糖凝膠電泳的方法，使用6對微衛星引物和BDNF基因對新疆地區7個葉城沙蜥群體進行遺傳多樣性分析。研究發現7個葉城沙蜥群體在6個微衛星位點上的近交系數均值為0.082，Shannon多樣性指數為1.336；遺傳分化指數均值為0.175，基因流均值為3.473，表明群體間遺傳交流水平低，存在較高程度的遺傳分化；群體單倍型多樣性范圍為0.345～0.806及核苷酸多樣性范圍為0.001 04～0.002 66。目前我國葉城沙蜥群體的遺傳多樣性處于中等水平，群體間的遺傳分化受自身遷移能力和地理隔離等因素影響，亟需對我國葉城沙蜥進行種質資源保護，防止其遺傳多樣性繼續下降。

哈迪-溫伯格平衡是評價種群遺傳平衡的參數，處于遺傳平衡的種群不容易受到近交及外來種群的干擾［31］，種群相對穩定。瀕危物種常常表現HWE平衡偏離，造成偏離的原因很多，如近親交配、種群遷移和遺傳漂變等。該研究中有6個位點偏離HWE平衡，均為雜合不足，且表現近親繁殖。對新疆7個地區葉城沙蜥的微衛星和核基因進行擴增測序進行分析，研究其遺傳多樣性，但目前的數據無法證明葉城沙蜥種群表現的遺傳特征及原因，有待進一步研究，該研究補充和豐富了新疆部分地區葉城沙蜥的基礎遺傳數據，可為后續合理利用及保護該地區內其他物種的種質資源奠定基礎。

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基金項目 國家自然科學基金地區科學基金項目（32060311）；甘肅省自然科學基金項目（20JR10RA124）；西北民族大學中央高?；究蒲袠I務費項目（31920210143，31920200004，31920190083）；西北民族大學研究生科研創新項目（Yxm2021076）。

作者簡介 謝慧（1997—），女，河南商丘人，碩士研究生，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。*通信作者，副教授，博士，碩士生導師，從事分子生態與進化生物學研究。

收稿日期 2022-07-27