小檗堿激活SIRT1/AMPK信號通路改善高糖誘導的系膜細胞異常增殖和自噬功能

楊 琳,王蓉蓉,郭小雨,唐麗琴,2,魏 偉

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見的慢性并發癥之一,由于腎小球及血管病變而導致的蛋白尿排泄增多以及腎功能異常[1],病因復雜,病情反復。DN在病理上主要表現為腎小球結構肥大、細胞外基質積聚、足細胞損傷和系膜細胞(mesangial cells, MCs)異常增殖等[2]。沉默信息調節因子1(silencing regulatory factor 1,SIRT1)/腺苷酸活化蛋白激酶(adenylate activated protein kinase,AMPK)信號通路存在相互調控的關系,SIRT1是一種依賴性脫乙酰酶,可以使AMPK蛋白脫乙酰化,參與炎性反應的調節,減緩DN發生及發展[3]。已有研究[4]表明,DN的發病機制可能與系膜細胞自噬水平失調有關。小檗堿(berberine,BBR)是一種季銨類生物堿,見于許多植物中,藥理作用主要有抗炎抗腫瘤、促進胰島素分泌和保護腎臟[5]的作用等。課題組前期研究[6]表明,BBR可以通過多種途徑改善DN。該課題研究了BBR能夠改善高糖誘導的MCs的異常增殖、降低ECM沉積并提高自噬水平等保護作用,其機制可能與調節SIRT1/AMPK信號通路有關,以期為探尋DN治療靶點提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞腎小球系膜細胞(CL-0470)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物BBR(BWC9020-2016):分子量371.81,購自北京北方偉業計量技術研究院,通過HPLC法測定純度≥98%。

1.3 試劑DMEM培養基購自美國Hyclone公司(貨號:SH30021.01);AMPK抑制劑購自美國默克公司(CC,貨號:171260);細胞爬片、一抗稀釋液、胰酶購自美國Biosharp公司;胎牛血清購自加拿大Wisent公司;兔抗 Col-IV 抗體、鼠抗Sirt1抗體購自英國Abcam公司(貨號:ab6586、ab110304);兔抗LC3B抗體、兔抗AMPK抗體、兔抗 p-AMPK 抗體、兔抗p65 抗體、兔抗p-p65抗體購自美國Cell Signaling Technology公司(貨號:3868S、5831、2535T、8242S、3033);兔抗Beclin1抗體、兔抗p62抗體、羊抗兔熒光二抗、羊抗小鼠熒光二抗(貨號:R1509-1、HA721171、HA1121、HA1125)購自杭州華安生物技術有限公司;鼠抗 FN抗體購自武漢Proteintech公司(貨號:66042-1-Ig)。

1.4 儀器化學發光成像系統(型號:ImageQuant,美國GE公司);酶標儀(型號:Infinite M1000 PRO,瑞士TECAN公司);高內涵細胞成像(型號:Image Xpress Micro 4,美國Molecular Devcies 公司);正置熒光顯微鏡(型號:DM2500,德國萊卡公司)。

1.5 方法

1.5.1細胞培養 凍存細胞用37 ℃水浴并混勻1～2 min至完全融化,離心去上清液,加入含有10%血清、1%雙抗的低糖培養液,反復吹打后放置于在37 ℃含5% CO2和95%濕空氣中孵育。

1.5.2細胞增殖 將消化下來的細胞接種在96孔板中(1 000個/孔),細胞貼壁后隨機分為5組,即正常組(Control組,葡萄糖濃度 11.1 mmol/L)、模型組(HG組,葡萄糖濃度 30 mmol/L)和不同濃度 BBR 給藥組(30、60、90 μmol/L)。24 h后吸出廢液,預冷的4%多聚甲醛固定30 min, 5% BSA封閉30 min,用錫紙包住96孔板,接著加入DAPI 20 μl染核5 min,最后用高內涵成像儀拍攝細胞,計算各組系膜細胞數量并分析。

1.5.3免疫熒光法檢測ECM沉積蛋白的表達 24孔板內加入無菌蓋玻片,再以1×104個/孔密度的細胞懸液加入到孔板中,分別加刺激和給藥。24 h后洗去上層死細胞,依次加入預冷的4%多聚甲醛固定30 min,0.1% Triton X-100通透細胞5 min,5% BSA封閉30 min,加入比例為1 ∶100的抗體,次日用錫紙包住24孔板,隨后加入相對應的熒光二抗(1 ∶100)37 ℃ 暗處孵育 2 h,DAPI染液100 μl染核10 min;最后滴加熒光淬滅劑,于488 nm 激發光觀察并拍照。

1.5.4Western blot檢測相關蛋白表達 將消化下來的細胞接種在6孔板中(1×108個/孔),分別加刺激和給藥同1.5.2項,培養24 h后吸去廢液,預冷RIPA加PMSF后,放于冰上1 h使之完全裂解,將裂解后的細胞轉移至EP管并離心,定量后將蛋白進行SDS-PAGE 電泳,再分別孵育蛋白對應抗體,過夜后加入二抗(1 ∶1 000)搖床孵育2 h,最后洗膜并用顯影儀上檢測后保存結果。

2 結果

2.1 BBR對MCs增殖的影響高內涵實驗結果顯示,與對照組(Control組)(2 032.88±34.80)比較,高糖組(HG組)(7 126.33±24.29)MCs增殖能力增加(F=303,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(30、60、90 μmol/L)能明顯抑制MCs異常增殖 (5 652.39±36.86,4 402.34±31.40,2 317.05±11.19)。見圖1。

圖1 BBR對MCs增殖的影響 ×200

2.2 BBR對ECM沉積蛋白表達的影響免疫熒光結果顯示(圖2A),與對照組比較(1.661±0.305,1.674±0.151),高糖組(5.232±0.765,3.904±0.693)MCs中FN和Col-IV的熒光強度增加(F=188.4、55.88,P<0.01);與高糖組比較,BBR 治療組(2.001±0.235,1.872±0.09)MCs中FN和Col-IV的熒光強度降低。Western blot結果顯示(圖2B),與對照組比較,高糖組MCs中FN和Col-IV蛋白表達量增加(F=16.63、2.63,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(90 μmol/L)MCs中FN和Col-IV的蛋白表達量降低。

2.3 BBR對MCs上SIRT1、p-AMPK、p-p65蛋白表達的影響Western blot結果顯示,與對照組比較,高糖組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白表達量下降(F=24.73、26.50,P<0.01),p-p65蛋白表達量上升(F=7.448,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(30、60、90 μmol/L)MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達量上升,p-p65蛋白表達量下降。見圖3。

圖 2 BBR對ECM沉積蛋白表達的影響

圖3 BBR對SIRT1、p-AMPK、p-p65蛋白表達的影響

2.4 BBR對MCs上LC3B、Beclin-1、p62蛋白表達的影響Western blot結果顯示,與對照組比較,高糖組MCs上LC3B、Beclin-1蛋白表達量下降(F=9.572、3.194,P<0.01), p62蛋白表達上升(F=3.154,P<0.01);與高糖組比較,BBR 治療組(30、60、90 μmol/L)MCs上LC3B、Beclin-1蛋白表達量上升,p62蛋白表達量下降。見圖4。

圖4 BBR對LC3B、Beclin-1、p62蛋白表達的影響

2.5 BBR聯合CC后對MCs增殖和自噬的影響Western blot結果顯示(圖5A),高糖組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白表達量下降(F=14.46、65.72,P<0.01);與高糖組比較,BBR治療組(90 μmol/L)MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達量上升,與BBR治療組(90 μmol/L)比較,BBR(90 μmol/L)+CC組MCs上SIRT1、p-AMPK蛋白的表達量下降。高內涵(圖5B)和免疫熒光(圖5C)結果顯示,BBR治療組(90 μmol/L)能抑制高糖誘導的系膜細胞增殖,促進系膜細胞自噬(0.922±0.055),而加入AMPK抑制劑后(0.613±0.068),這種作用被部分抵消。

圖5 BBR聯合CC后對MCs增殖和自噬的影響

3 討論

數據顯示,中國糖尿病患者約1.409億,占全球第一,30%～40%的糖尿病患者有進展為DN的高風險[7]。DN的發生受多種因素調控,如遺傳因素、多元醇積聚、腎臟纖維化、炎性反應機制等[8]。腎小球系膜區包括MCs和系膜基質,MCs內有較強的收縮系統,刺激細胞內可收縮的纖維絲收縮,從而調節毛細血管表面積[9]。MCs的異常增殖及大量ECM的產生是導致腎小球纖維化主要始動因素,MCs增殖會導致鄰近的毛細血管血流循環障礙,血管壓力增大,濾過率下降,而細胞外基質沉積進一步壓迫毛細血管,加重了腎損傷,已有研究[6,10]表明,高糖能促進細胞的增殖和細胞外基質沉積。近年來,自噬是腎臟疾病的研究熱點,參與了多種腎臟疾病的過程。高糖刺激MCs會導致細胞內受損蛋白和細胞器堆積,自噬體能把受損物質包裹起來并與溶酶體融合,細胞內蛋白和細胞器被溶酶體消化代謝,自噬體減少,加重了腎纖維化[11]。本次研究結果顯示,使用30 mmol/L葡萄糖刺激MCs 24 h后,檢測顯示MCs細胞數增多,細胞增殖明顯,細胞外基質FN和Col-IV的表達水平升高,MCs上LC3B、Beclin-1自噬蛋白水平降低,p62蛋白水平升高。

SIRT1與AMPK存在相互調節的關系,SIRT1屬于sirtuins蛋白質家族,它是與機體能量代謝密切相關的蛋白。AMPK是一個復雜的異源三聚體,是由α,β和γ亞基及其各自的結構域組成,α亞基包含關鍵的殘基THr 172,它可以被上游激酶磷酸化,有研究[12]顯示,小檗堿可以通過激活AMPK磷酸化位點THr172改善衰老有關疾病。SIRT1可以激活AMPK上游分子LKB1,使AMPK磷酸化,AMPK同樣可以使細胞內NAD+增多反過來激活SIRT1,而SIRT1可與p65蛋白的亞基相互作用,使p65去乙酰化,p65蛋白表達降低,減少腎損傷的發生。此外,AMPK的激活可以調節代謝水平,減少ATP消耗,增加ATP的產生。研究[13]表明,人參皂苷Rb2通過激活 Sirt1和AMPK恢復自噬來緩解肝脂堆積。BBR可促進AMPK激活,增強自噬作用,抑制高糖誘導的足細胞損傷[14]。在DN模型中,CC作為AMPK抑制劑,可以阻斷AMPK通路后導致MCs異常增殖和ECM沉積。以上研究表明通過激活SIRT1/AMPK信號通路,加強了自噬作用,改善了細胞異常增殖,發揮保護腎臟的作用。

BBR是生活中治療胃腸道疾病的常用藥物,其藥理作用十分廣泛,研究表明,BBR在抗氧化、抗菌、神經保護、糖尿病以及心血管疾病等同樣具有比較好的生物效應[15]。該實驗通過檢測 SIRT1/AMPK信號通路的相關蛋白表明,HG 刺激MCs后,MCs發生異常增殖和細胞外基質沉積、細胞自噬水平降低及細胞SIRT1/AMPK信號通路失活,BBR 給藥后MCs發生異常增殖和細胞外基質堆積現象隨之減輕,細胞自噬水平增加并激活了SIRT1/AMPK信號通路,而BBR聯合AMPK抑制劑CC后,細胞內SIRT1/AMPK通路蛋白減少,MCs發生異常增殖并抑制了自噬的形成。