低氧經miR-130a-3p靶向Sirt7對人滋養細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化的影響

楊春芬,鐘黎黎,盛 瑩

子癇前期(preeclampsia,PE)是發生在妊娠20周后的特發性疾病,伴隨高血壓、蛋白尿、惡心等癥狀,是導致孕產婦妊娠期及圍生兒死亡的主要因素[1]。目前,PE病因和發病機制尚不清楚。有研究[2]表明,在妊娠早期胎盤組織形成初始階段,持續低氧會致使滋養細胞凋亡、侵襲能力降低,導致胎盤血管及器官發育異常,可能是PE病發的主要因素。miRNA是一類真核生物內源性、具有調控功能的小分子非編碼單鏈RNA,參與不同生物過程的調節,包括發育模式、細胞分化、細胞增殖等過程。miR-130a-3p作為miRNA的一員,在細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化(mesenchymal transformation,EMT)等過程中起重要作用。例如,Chen et al[3]研究表明,上調miR-130a-3p抑制乳腺癌細胞活性、遷移、侵襲和EMT進展。Yang et al[4]研究表明,miR-130a-3p在PE患者胎盤組織中高表達,但具體功能和作用機制不詳。去乙酰化酶(sirtuin-7,Sitr7)在機體中發揮多種調控作用,如細胞衰老、應激、腫瘤發生等。有研究[5]表明,Sitr7能夠保護H9C2心肌細胞和原代心肌細胞免受低氧誘導的損傷和細胞凋亡。但Sitr7在滋養層細胞中表達情況以及miR-130a-3p是否可靶向Sitr7調控PE發展進程,目前還尚未見報道。因此,該研究旨在探討低氧條件下經miR-130a-3p靶向Sirt7對人滋養細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化的影響及其作用機制,為PE的治療提供新的靶點及理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/SVneo(美國ATCC公司);RPMI-1640培養基、胎牛血清(美國Sigma公司);Sirt7抑制劑97491(美國Selleck公司);Transwell小室(美國Corning公司);Matrigel基質膠(美國BD公司);miR-130a-3p mimics及其陰性對照mimics-NC、miR-130a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC(廣州銳博生物技術有限公司);Lipofectamine 2000試劑盒(美國Introvigen公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);Sirt7抗體、HIF-1α抗體、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體、MMP-9抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin 抗體、Vimentin抗體、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶(HPR)偶聯的二抗(北京博奧森生物技術有限公司);FQD-16A熒光定量PCR儀(杭州博日科技股份有限公司);Tanon-5200化學發光成像系統(上海天能科技有限公司);XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學有限公司)。

1.2 細胞培養HTR-8/SVneo細胞采用含5%胎牛血清的RPMI-1640培養基并置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養,每2 d傳代1次。

1.3 細胞轉染取對數期HTR-8/SVneo細胞,調整細胞密度以2×105個/孔接種于6孔板中過夜,待細胞密度達70%時,使用Lipofectamine 2000將miR-130a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor-NC轉染至HTR-8/SVneo細胞中,將細胞依次分為miR-130a-3p inhibitor組和inhibitor-NC組,另設置空白對照組(blank),置于培養箱培養48 h后,采用qRT-PCR檢測轉染效率。

1.4 細胞處理及分組第1部分實驗:探討低氧誘導過程中HTR-8/SVneo細胞中miR-130a-3p和Sirt7表達水平,即將HTR-8/SVneo細胞分為常氧組和低氧組,其中常氧組細胞采用常氧培養條件(21%O2+5%CO2+74%N2)分別培養12、24、48 h;而低氧組細胞采用低氧條件(1%O2+5%CO2+94%N2)分別培養12、24、48 h。第2部分實驗:探討抑制miR-130a-3p表達對低氧條件HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲及EMT的影響及機制,根據實驗需要作如下分組,對照組(Con組):未經轉染的HTR-8/SVneo細胞在常氧條件下培養48 h;低氧組(Hyp組):未經轉染的HTR-8/SVneo細胞在低氧條件下培養48 h;低氧+inhibitor NC組(Hyp+ inhibitor NC組):轉染inhibitor NC的HTR-8/SVneo細胞在低氧條件下培養48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor組(Hyp+inhibitor組):轉染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo細胞在低氧條件下培養48 h;低氧+miR-130a-3p inhibitor+Sirt7抑制劑97491組(Hyp+inhibitor +97491組):轉染miR-130a-3p inhibitor的HTR-8/SVneo細胞采用10 μmol/L Sirt7抑制劑97491預處理2 h,再在低氧條件下培養48 h。

1.5 Transwell檢測細胞遷移及侵襲能力取對數期HTR-8/SVneo細胞,細胞密度為2×105個/孔接種于6孔板中,待細胞密度達70%時進行分組處理。收集各組細胞,使用無血清培養基調整細胞濃度至2×105個/ml,上室加入200 μl細胞懸液,下室加入600 μl 含10%胎牛血清的完全培養基,培養24 h后,取出小室,經固定、染色、水洗、晾干處理,使用顯微鏡拍照并記錄遷移細胞數目。細胞侵襲:提前在小室中加入50 μl基質膠(1 mg/ml)置于培養箱中溫育4 h,其他步驟同遷移實驗。

1.6 qRT-PCR檢測細胞中miR-130a-3p和Sirt7 mRNA表達水平分組處理后收集各組細胞沉淀,使用總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA。采用反轉錄試劑盒反轉錄總RNA為cDNA,并以此為模板進行PCR擴增反應。PCR條件為94 ℃預變性30 s,94 ℃變性30 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸45 s,擴增35個循環后,72 ℃終末延伸10 min。以U6或GAPDH為內參,采用2-△△Ct法計算miR-130a-3p與Sirt7相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 Western blot實驗取對數期HTR-8/SVneo細胞,調整細胞密度以2×105個/孔接種于6孔板中,過夜,按1.4項下第2部分實驗分組處理后收集各組細胞沉淀,加入RIPA裂解液充分裂解,使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白含量。取40 μg蛋白經金屬浴煮沸10 min變性,經電泳、轉膜及封閉處理后,加入Sirt7抗體(1 ∶1 000)、HIF-1α抗體(1 ∶1 000)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體(1 ∶1 000)、MMP-9抗體(1 ∶1 000)、E-cadherin抗體(1 ∶1 000)、N-cadherin抗體(1 ∶1 000)、Vimentin抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。洗膜3次后,加入辣根過氧化物酶(HPR)偶聯的二抗(1 ∶10 000)在室溫下孵育1 h,洗膜3次,滴加ECL顯影液。使用Image J軟件分析待測蛋白的相對GAPDH的表達水平。

1.8 雙熒光素酶實驗驗證miR-130a-3p與Sirt7靶標關系采用在線miRNA靶基因預測網站TargetScan Human 7.1預測miR-130a-3p與Sirt7 基因3′-UTR區域結合位點。設計合成Sirt7野生型(Sirt7-WT)和Sirt7突變型(Sirt7-Mut)熒光素酶表達載體,合成相應熒光素酶載體質粒,使用Lipofectamine 2000將Sirt7-WT、Sirt7-Mut分別與miR-130a-3p mimics、mimics-NC轉染至HTR-8/SVneo細胞中,轉染后檢測相應熒光素酶活性,即螢火蟲熒光素酶的檢測值與海腎熒光素酶檢測值的比值(Firefly Luciferase/Renilla Luciferase)。

2 結果

2.1 低氧對HTR-8/SVneo細胞中miR-130a-3p和Sirt7表達水平影響qRT-PCR實驗結果(圖1A)顯示,與常氧組比較,低氧12、24、48 h后低氧組細胞中miR-130a-3p表達水平逐漸升高(F=46.295,P<0.001),而Sirt7 mRNA表達水平逐漸降低(F=75.993,P<0.001)。Western blot結果(圖1B)顯示,與常氧組比較,低氧12、24、48 h后低氧組細胞中Sirt7蛋白表達水平逐漸降低(F=18.152,P<0.001)。

圖1 各組細胞中miR-130a-3p、Sirt7表達水平

2.2 抑制miR-130a-3p表達對低氧條件下HTR-8/SVneo細胞中miR-130a-3p和Sirt7表達水平影響qRT-PCR結果顯示,與blank組比較,miR-130a-3p inhibitor組細胞中miR-130a-3p表達水平降低(P<0.05),而inhibitor-NC組無變化(P>0.05),提示miR-130a-3p過表達的HTR-8/SVneo細胞構建成功,見圖2A。與Con組比較,Hyp組miR-130a-3p水平升高(P<0.05),Sirt7 mRNA水平降低;與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組miR-130a-3p水平降低(P<0.05),Sirt7 mRNA水平升高;與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組miR-130a-3p水平無變化(P>0.05),Sirt7 mRNA水平降低(P<0.05),見圖2B。

圖2 各組細胞中miR-130a-3p和Sirt7表達水平

2.3 抑制miR-130a-3p表達對低氧條件下HTR-8/SVneo細胞遷移和侵襲能力的影響Transwell結果(圖3)所示,與Con組比較,Hyp組細胞遷移及侵襲數目減少(P<0.05);與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組細胞遷移及侵襲數目增加(P<0.05);與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組細胞遷移及侵襲數目減少(P<0.05)。

圖3 抑制miR-130a-3p表達對低氧條件下HTR-8/SVneo細胞遷移和侵襲能力的影響 ×200

2.4 抑制miR-130a-3p表達對低氧條件下HTR-8/SVneo細胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平的影響Western blot結果(圖4)顯示,與Con組比較,Hyp組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05);與Hyp+inhibitor NC組比較,Hyp+inhibitor組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平升高(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平降低(P<0.05);與Hyp+inhibitor組比較,Hyp+inhibitor+97491組Sirt7、MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白水平降低(P<0.05),HIF-1α和E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)。

圖4 各組細胞中Sirt7、HIF-1α、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平

2.5 miR-130a-3p靶向Sirt7調控關系驗證在線miRNA靶基因預測網站TargetScan Human 7.1數據庫預測結果(圖5A)顯示,Sirt7的3′-UTR中存在與miR-130a-3p互補序列。雙熒光素酶報告結果(圖5B)顯示,與mimics-NC組比較,miR-130a-3p mimics組與Sirt7-WT組共轉染后可以降低其熒光素酶活性[(1.03±0.01)vs(0.24±0.03),P<0.05],而與Sirt7-Mut共轉染后對其熒光素酶活性無影響[(1.02±0.01)vs(1.01±0.01),P>0.05]。

圖5 miR-130a-3p靶向Sirt7調控關系驗證

3 討論

滋養層細胞維持正常的生理功能是胎盤正常發育和孕婦正常妊娠的前提。在妊娠早期,胎盤形成初始階段處于相對低氧的環境,這種環境可以促進滋養細胞侵襲及血管形成;然而,持續低氧導致的低氧誘導因子(HIF-1α)的持續高表達會導致胎盤發育異常,誘發與妊娠相關疾病的發生,如PE和胎兒生長受限[6-7]。該研究結果顯示,miR-130a-3p可靶向Sirt調控HIF-1α進而影響低氧條件下滋養層細胞HRT-8/SVneo遷移、侵襲及上皮-間質轉化。

既往研究[8-9]表明,不同miRNA在正常妊娠和PE妊娠的胎盤組織中表達有所差異,同時這些 miRNA介導的滋養層功能揭示了PE的發病機制。miR-130a-3p是miR-130家族成員之一,其調控細胞增殖、遷移、侵襲等生物學功能已有研究揭示。例如在癌癥研究[10]中,miR-130a-3p在結直腸癌組織中表達下調,可靶向WNT1抑制結直腸癌細胞增殖;然而,胃癌組織和細胞系中miR-130a-3p水平上調,可通過激活下游信號通路促進胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[11];此外,miR-130a-3p 在體外和體內均可抑制人食管鱗狀細胞癌EC-1細胞的遷移、侵襲及上皮-間質轉化[12]。目前,關于miR-130a-3p在PE中作用機制還尚未見報道。該研究表明miR-130a-3p在低氧誘導的人滋養層細胞HTR-8/SVneo中表達上調。實驗結果顯示,敲低miR-130a-3p表達可促進低氧條件下HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲,上調MMP-2、MMP-9、N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平,下調E-cadherin蛋白表達水平,說明敲低miR-130a-3p表達對PE有治療作用。該研究結果顯示敲低miR-130a-3p表達可上調Sirt7蛋白表達水平,下調HIF-1α蛋白表達水平。然而,miR-130a-3p與Sirt7的靶向關系以及Sirt7是否參與HIF-1α的調控仍需進一步研究。

Sirt7是sirtuin家族中一員,其作為一個關鍵的轉錄因子在多種癌癥的發生發展過程中發揮重要的調節作用,如對于表觀遺傳學的調控、維持惡性腫瘤細胞的表型、調控腫瘤細胞的特異性生長、細胞侵襲以及細胞轉移等腫瘤的生物學過程[13-14]。HIF-1α是具有轉錄活性的核蛋白,參與細胞增殖、分化、血管形成等多種生理進程。Hubbi et al[15]研究表明敲低Sirt7表達可上調HeLa、Hep3B、MDA-MB-231和293T細胞中HIF-1α蛋白表達水平。張展 等[16]研究表明,低氧可促進滋養細胞JEG-3中HIF-1α表達,沉默HIF-1α可抑制其侵襲和遷移能力。然而,Sirt7與HIF-1α在PE發展進程中的關系未知。該實驗結果顯示,Sirt7在低氧誘導的HTR-8/SVneo細胞中表達下調,其表達上調可降低HIF-1α水平,并促進低氧誘導的HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化。進一步研究表明,miR-130a-3p inhibitor聯合Sirt7抑制劑干預后,可逆轉miR-130a-3p低表達對低氧HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化的促進作用,并上調HIF-1α表達。此外,該研究通過雙熒光素酶報告表明miR-130a-3p與Sirt7之間存在靶向調控關系,提示miR-130a-3p靶向Sirt7調控HIF-1α進而影響低氧條件下HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化。

綜上所述,敲低miR-130a-3p表達可促進低氧條件下HTR-8/SVneo細胞遷移、侵襲及上皮-間質轉化,其機制可能與靶向調控Sirt7有關。該研究可為治療PE提供新的思路,但仍需體內實驗研究來進一步闡明miR-130a-3p在PE中作用的分子機制。