APETx2對感染后腸易激綜合征小鼠內臟敏感性的作用及機制

肖紅云,李 歡,閆 波,潘 穎,田平平,袁麗萍,3

感染后腸易激綜合征(post-infection irritable bowel syndrome,PI-IBS)是一種常見的功能性胃腸道疾病,其特征是在急性胃腸炎發作后出現慢性間歇性腹痛、結腸運動障礙和腸道習慣改變[1]。據報道,約3.7%～36.0%的IBS患者有急性胃腸炎或寄生蟲感染病史。IBS 的病理生理機制尚未完全闡明,大量研究[2]表明,腸道黏膜的低度炎癥、腸道黏膜屏障的功能障礙和內臟高敏感在介導PI-IBS的發病機制中起著重要作用。目前IBS的治療方法主要是暫時緩解癥狀,藥物治療對腹痛和腹脹等癥狀療效不確切。

酸敏感離子通道 (acid sensing ion channels,ASICs) 主要是由細胞外酸化激活的質子門控陽離子通道,可以檢測因組織損傷、炎癥、缺血等發生的組織酸中毒,從而激活周圍的痛覺神經并將疼痛信號傳輸到中樞[3]。ASICs在整個疼痛通路中廣泛表達,特別是酸敏感離子通道 3(acid sensing ion channel 3,ASIC3)在周圍神經系統中廣泛分布。研究表明抑制ASIC3在胃腸道的表達,可以降低IBS的結腸擴張壓力和內臟超敏反應。該研究旨在探討一種強效的 ASIC3 選擇性阻斷劑APETx2對 PI-IBS 小鼠內臟超敏反應的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級成年NIH雄性小鼠18只,4～6 周齡,體質量20～25 g, 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,合格證號為SCXK(京)2016-0011。小鼠飼養于安徽醫科大學實驗動物中心,分籠飼養、自由飲食,12 h 光照、黑暗交替節律。所有小鼠實驗前在同一環境中適應性喂養7 d。

1.2 主要試劑APETx2(上海信裕生物科技有限公司);印度墨汁(上海源葉生物科技公司);兔抗小鼠瞬時受體電位香草素1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1 )(BS60454, 美國Bioworld公司);兔抗小鼠降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)(DF7386,美國Affinity公司);兔抗小鼠ASIC3(bs-12132R,北京博奧森生物技術有限公司);TRIzol試劑(15596018,美國 Thermo 公司);逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa 公司); HRP-羊抗兔IgG (ZB-2301,北京中杉金橋生物技術有限公司);RIPA細胞裂解液(P0013B,上海碧云天生物技術有限公司);PVDF 膜(IPVH00010,上海密理博貿易有限公司)。

1.3 PI-IBS 模型制備及給藥NIH小鼠采用含400～500條旋毛蟲幼蟲的0.2 ml生理鹽水灌胃,構建PI-IBS模型;根據腹壁回撤反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)結果評估內臟敏感性,選擇造模成功小鼠進行實驗。將這些小鼠隨機分為PI-IBS組、APETx2組,同時設立對照組,每組6只。對照組給予等體積生理鹽水灌胃。飼養8周后,APETx2組給予120 μg/kg APETx2,每天腹腔注射1次,連續7 d;對照組和PI-IBS組則給予等體積生理鹽水,每天腹腔注射1次,連續7 d。幼蟲從先前感染的旋毛蟲的雄性昆明小鼠中獲得。

1.4 各組小鼠一般情況觀察各組小鼠毛色、活動情況、對外界反應情況、糞便性狀。

1.5 各組小鼠腸道動力檢測給藥結束后,小鼠均用0.2 ml的印度墨汁灌胃。各組小鼠單籠飼養。記錄每只小鼠首次排黑便的時間并收集糞便顆粒數每2 h一次,持續6 h。該實驗用于評估小鼠胃腸道功能情況。

1.6 AWR測試評估小鼠內臟敏感性實驗前將小鼠禁食24 h自由飲水后,輕輕麻醉小鼠,將8 F導尿管插入肛門 6～8 cm并固定在尾部。之后將小鼠放在透明盒上,保證小鼠只能一個方向運動且不能翻轉。在小鼠從麻醉中完全恢復后,向氣囊內注入水。水容量依次為 0.25、0.35、0.50、0.65 ml。球囊擴張每次持續30 s并評估腹部退縮反射后休息20 s,重復 3 次,進行下一梯度時間隔5 min。觀察小鼠對不同程度擴張壓力的行為反應。操作者和觀察者采取雙盲的方法進行 AWR 評分,取3次數據的平均值作為結果。AWR評分標準:0 分,對刺激無反應;1 分,僅出輕微的頭部運動;2 分,腹部肌肉輕度收縮但腹部未抬起;3 分,腹部肌肉強烈收縮且腹部抬起;4 分,腹部肌肉收縮更強烈,背部拱起,腹部、骨盆和會陰部抬離地面。

1.7 免疫組織化學法檢測小鼠結腸組織中CGRP蛋白表達將小鼠結腸組織,于PBS溶液中沖洗,石蠟包埋,4%多聚甲醛固定后切成5 μm厚切片。脫蠟、水化和抗原高壓修復后。將切片與一抗CGRP(1 ∶300)在37 ℃下孵育1 h。滴加二抗孵育30 min后,滴加DAB顯色劑,復染、脫水后封片,在光學顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus圖像分析系統采集并分析每張切片的平均吸光度值(mean optical density,MOD)。MOD值越大意味陽性表達越高。每張切片隨機讀取200倍視野進行觀察。

1.8 qRT-PCR法檢測小鼠結腸組織中腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、CGRP mRNA表達水平使用TRIzol試劑從結腸組織中提取總RNA。按照逆轉錄試劑盒說明書,將RNA逆轉錄成cDNA。使用 SYBR Green PCR Kit進行PCR擴增,加入上、下游引物。所有引物均由上海生工生物工程構建。具體步驟: 95 ℃,60 s,1個循環進行預變性;95 ℃,20 s,60 ℃,60 s,40個循環為PCR反應條件。采用 2- △△Ct公式分析目的基因的相對表達量,其中△Ct值=目的基因 Ct 值-β-actin Ct 值。以β-actin作為內參,所有基因引物序列信息見表1。

表1 基因的引物序列

1.9 Western blot法檢測小鼠腦組織中ASIC3、CGRP和TRPV1蛋白表達用RIPA裂解液提取總蛋白,5～10 μl蛋白樣品電泳,轉移并封閉,然后用一抗ASIC3(1 ∶1 000)、CGRP(1 ∶1 000)和TRPV1(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。然后與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體(1 ∶20 000)在室溫下孵育1 h。之后使用ECL發光試劑盒檢測蛋白。用Image J軟件讀取目標條帶的灰度值,以GAPDH為內參,對目的蛋白進行半定量分析。

2 結果

2.1 各組小鼠一般情況比較對照組小鼠皮毛整齊有光澤,糞便呈顆粒狀硬度適中,活動量正常。PI-IBS組小鼠活動減少,皮毛光澤變暗,形體未見明顯消瘦,有不同程度的稀便,糞便不成型。與PI-IBS組比較,APETx2組小鼠活動增加,較前溫順,皮毛恢復光澤,糞便多成型,硬度適中。

2.2 各組小鼠首次排黑便時間及6 h糞便顆粒數的比較對照組、PI-IBS組和APETx2組的小鼠首次排黑便的時間分別為(387.10±47.81)、(110.00±17.35)、(337.80±76.02)min。與對照組相比,PI-IBS組的小鼠首次排黑便的時間顯著降低(P<0.01);與PI-IBS組相比,APETx2組的小鼠首次排黑便的時間顯著延長(P<0.01)。與對照組相比,PI-IBS組小鼠在2、4、6 h的糞便顆粒數明顯增加(P<0.01)。與PI-IBS組相比,APETx2組的小鼠2、4、6 h的糞便顆粒數明顯減少(P<0.01)。結果表明,APETx2治療改善了PI-IBS小鼠的胃腸道運動能力。見表2。

表2 各組小鼠首次排黑便時間及6 h糞便顆粒數

2.3 各組小鼠AWR評分比較與對照組比較,當結直腸擴張的水容量依次為0.25～0.65 ml時,PI-IBS組AWR評分均顯著升高(P<0.01)。與PI-IBS組比較,APETx2組在結直腸擴張的水容量依次為0.25～0.65 ml時,APETx2組與PI-IBS相比AWR評分均顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠AWR評分

2.4 各組小鼠結腸組織中CGRP蛋白表達比較免疫組織化學染色顯示:CGRP在結腸中主要表達于黏膜層及黏膜下層的細胞質中,陽性細胞呈棕黃色。與對照組比較,PI-IBS組結腸中的CGRP陽性表達水平明顯升高(P<0.01)。與PI-IBS組比較,APETx2組中CGRP的陽性表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖1和表4。

圖1 免疫組化測定各組小鼠結腸組織中CGRP表達 ×200

表4 各組小鼠結腸組織中CGRP平均吸光度值

2.5 各組小鼠結腸組織BDNF、CGRP mRNA表達比較與對照組比較,PI-IBS組小鼠結腸組織中BDNF、CGRP mRNA表達明顯增加(P<0.01)。與PI-IBS組比較,APETx2組小鼠結腸組織中的BDNF、CGRP mRNA表達水平明顯降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組小鼠結腸組織BDNF、CGRP mRNA表達水平

2.6 各組小鼠腦組織中ASIC3、CGRP和TRPV1蛋白表達比較與對照組比較,PI-IBS組腦組織中ASIC3、CGRP和TRPV1蛋白的表達顯著增多(P<0.01)。與PI-IBS組比較,APETx2組腦組織ASIC3、CGRP和TRPV1蛋白的表達顯著減少(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠腦組織中ASIC3、CGRP和TRPV1蛋白表達

3 討論

IBS的是一種多因素導致的疾病,其中內臟超敏反應是導致IBS癥狀的主要原因。IBS慢性內臟超敏反應的機制尚不清楚,但是ASIC3作為酸性和原發性炎癥疼痛的傳感器,參與內臟超敏反應的信號轉導。因此,假設抑制ASIC3通道可以緩解IBS的內臟超敏反應。實驗結果顯示APETx2,一種特異性的ASIC3通道阻斷劑,可以明顯改善PI-IBS小鼠因感染旋毛蟲而引起的內臟超敏反應以及胃腸道傳輸功能。

內臟敏感性增高涉及復雜的超敏反應過程,主要包括外周和中樞神經系統的異常相互作用以及腦腸肽異常分泌等[4]。其中,TRPV1、CGRP、BDNF作為相關神經肽參與IBS的發展過程并對腸神經系統具有調節作用。ASIC3在周圍神經系統和傷害感受器中廣泛表達,用于檢測與組織酸中毒相關的疼痛。胃腸道的慢性炎癥、癌癥和缺血往往伴隨著組織酸化,這激活了周圍感覺神經細胞上的ASIC3蛋白,從而介導胃腸道疾病的慢性腹痛[5]。同時,ASIC3也參與結腸對機械刺激的過敏反應,這些功能影響及其炎癥和非炎癥病理的上調使ASIC3 成為管理與功能性胃腸道疾病相關的內臟過敏和疼痛的潛在目標[6]。該研究顯示,與PI-IBS組比較,APETx2顯著降低PI-IBS小鼠腦組織ASIC3含量。同時,小鼠胃腸道傳輸功能測定結果表明,給藥后,小鼠首次排黑便時間與6 h內糞便顆粒數均顯著降低(P<0.01)并且小鼠直腸擴張的疼痛閾值明顯增加。結果提示,APETx2可以通過下調腦組織ASIC3含量從而調節PI-IBS內臟敏感性、改善IBS的結腸運輸功能。

TRPV1屬于瞬時受體電位(TRP)通道家族,是一種鈣滲透性的離子通道,在胃腸道中廣泛表達[7]。TRPV1可以感知病理性疼痛,從而產生痛覺過敏,整合疼痛信號[8]。TRPV1通過辣椒素的激活促進Ca2+內流,作用于初級傳入纖維CGRP和其他腦腸肽,從而調節內臟感覺和胃腸道運動[9]。CGRP是一種胃腸肽,廣泛存在于胃腸道壁內的神經叢中,具有調節胃腸道運動和腸道疼痛傳入中樞作用,并作用于辣椒素敏感的感覺神經末梢[10-11]。CGRP調節腸道感覺和運動功能,增強腸道運動,并與腸道感覺異常和內臟超敏反應有關[12]。該研究APETx2組TRPV1和CGRP的表達水平顯著低于PI-IBS組。結果提示,APETx2可以通過下調TRPV1和CGRP的表達從而改善PI-IBS癥狀。

BDNF是一種廣泛表達在神經系統和外周組織中的神經營養因子,參與調節由不同刺激引起的疼痛超敏反應并在介導腸道感覺和運動方面起著重要作用[13-14]。在IBS患者中,BDNF的過度表達導致腸道黏膜神經結構的改變(增加黏膜神經纖維總數和超微結構損傷),從而導致腸道運動障礙。此外,BDNF升高的程度與腹痛的程度和頻率顯著相關,其異常升高可導致多種疼痛相關感覺,例如慢性疼痛、炎癥性疼痛和內臟疼痛。近年來,研究表明BDNF與許多慢性疼痛疾病有關,并且在胃腸道中也大量表達。BDNF不僅與一種或多種神經遞質聯合作用,還能增加P物質和CGRP等因子的釋放。結果顯示,PI-IBS組腦組織中BDNF和CGRP的表達水平以及結腸組織中CGRP的表達水平都顯著升高。APETx2治療明顯降低了腦組織中BDNF和CGRP的表達水平以及結腸組織中CGRP的表達。研究表明,APETx2可以通過降低BDNF表達水平進而通過下調CGRP表達來降低IBS的內臟超敏反應并改善結腸轉運功能。

綜上所述,ASIC3可能在旋毛蟲誘導的IBS的發展中起作用,在體內阻斷ASIC3的激活可以改善IBS的內臟敏感性和腸道傳輸功能。APETx2對PI-IBS小鼠內臟敏感性的調節作用包括腦腸肽的多個環節、水平和表達作用,對單一腦腸肽水平的變化或某一途徑的單一研究不能完全揭示APETx2調節IBS癥狀的復雜機制。ASIC3有可能成為IBS治療的一個潛在靶標。