Bmp2影響脂肪干細胞成骨能力的研究

賴文濤,趙志軍,張春陽

近些年來,骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins,Bmps)被證明在誘導成骨分化過程中發揮重要作用[1]。在Bmps的16個亞型中,Bmp2,4,6,7,9被認為是最具骨誘導性的[2]。通過外源性的添加Bmp2或在骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)中過表達Bmp2都能夠發揮其成骨分化的作用,以此來達成骨缺損修復的目的[3]。Gromolak et al[4]研究表明在體外用FGF2和Bmp2處理綿羊BMSCs后顯示OCN和I型膠原蛋白表達的增加,以及相關成骨基因的表達增高。因此,Bmps介導的骨缺損修復治療具有廣闊的研究價值。

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,Adscs)相比于其他類型的干細胞而言,具有來源廣泛、易于獲取、多向分化潛能、免疫原性低等特點。Caetano et al[5]報道支架/干細胞復合體骨再生更為顯著,表明了Adscs對修復骨組織缺損有積極影響。Adscs還可通過旁分泌的方式將生物活性因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等來促進缺損部位血管的形成。Han et al[6]研究表明低氧預處理后的外泌體能更高效的促進血管形成。這些特點有助于干細胞復合組織異體移植后降低免疫排斥反應,在臨床上應用前景廣泛。因此,該研究通過構建過表達Bmp2-Adscs模型,來探討Bmp2對于Adscs成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器DMEM 購自大連美侖生物技術有限公司,茜素紅、堿性磷酸酶試劑盒購自北京天根有限公司,2 × SYBR Green qPCR Mix購自上海biosharp公司,Runx2一抗、OPN一抗、Bmp2一抗、Bmp4一抗、Smad1/5與p-Smad1/5一抗均購自武漢博奧森有限公司,OCN一抗購自美國Invitrogen公司,Dlx2一抗、羊抗兔二抗均購自美國Abcam公司,β-actin一抗購自上海Santa有限公司,電穿孔轉染試劑盒套裝、酶標儀均購自美國Thermo Fisher公司。激光共聚焦顯微鏡 Nikon A1 購自日本Nikon公司,PCR儀 7900HT 購自美國ABI公司,紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher公司,Bmp2質粒購自武漢淼靈平臺。

1.2 實驗方法

1.2.1Adscs的提取及鑒定 大鼠購自維通利華生物技術有限公司。在整個研究過程中,所有大鼠都被保持在1個12 h的光/暗周期中,可以自由獲得食物和水。仰臥固定大鼠;從雙側腹股溝皮墊下取出脂肪,并去除多余組織,剪碎后放入含雙抗 PBS中進行沖洗。然后置換入離心管,加入0.1%的膠原酶;在溫箱中搖床消化1 h,用1 ml注射器反復吹打均勻后,分別用200目與400目的細胞篩過濾,濾液放入離心機中離心10 min,條件1 365 r/min,棄上清液,保留沉淀。使用流式細胞儀,CD90一抗鑒定Adscs。

1.2.2細胞誘導分化及分組 培養大鼠Adscs,鏡下觀察細胞長至40%～50%的融合度后對細胞進行成骨誘導分化。使用補充了Supplement Mix的成骨分化培養基(MSC Osteogenic)培養24 h后,更換新鮮培養基。培養至80%～90%的生長密度后,使用4%多聚甲醛固定,用PBS清洗后,通過茜素紅染色試劑盒進行染色,鏡下可見細胞被染成橘紅色。將誘導完成的細胞定位陽性對照,未經誘導分化的Adscs為空白對照組(Control組),轉染空載質粒的細胞為陰性對照組(Vector組),采用成骨誘導培養基培養的Adscs為成骨誘導組(Inducement組),轉染Bmp2質粒的細胞為實驗組。

1.2.3Bmp2質粒轉染 取1×106個生長狀態良好的Adscs,按照Neon Transfection System 電轉染試劑盒提供的方法進行 GFP-Bmp2質粒電轉染。條件設定為電壓1 200 mV、脈沖2次、間隔20 ms,轉染成功24 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞狀態。

1.2.4茜素紅與堿性磷酸酶染色 各組培養14 d后,以4%多聚甲醛固定并以PBS沖洗,按茜素紅試劑盒說明逐步加入茜素紅染液,并在37 ℃搖床中孵育,然后在鏡下觀察各組染色情況;同樣的,按堿性磷酸酶染色試劑盒說明逐步加入堿性磷酸酶染液,在暗室中孵育,然后在鏡下觀察染色情況,圖像使用Image J分析。

1.2.5qRT-PCR實驗 提取各組RNA,并測定 RNA濃度。將RNA反轉錄為cDNA。每組cDNA各取1 μl,利用 SYBR GreenⅠ試劑盒進行 real time PCR擴增,根據所得各組的Ct值,利用 2-ΔΔCt計算Bmp2、Bmp4、BSP、OPN、OCN、Runx2、Smad1、Smad5、Dlx2的mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6Western blot實驗 各組分別加入RIPA,超聲輔助裂解。在低溫超速離心機中離心,條件為12 000 r/min,15 min,并測定蛋白濃度。然后上樣進行電泳,電泳結束后使用400 mA恒流4 ℃轉膜過夜將蛋白轉移到0.22 μm的PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h,0.1% TBST沖洗,4 ℃孵育過夜。TBST沖洗,室溫條件下孵育羊抗兔二抗1 h,TBST沖洗后使用ECL超敏發光液進行化曝光顯影,使用Image J對蛋白條帶的灰度進行掃描。

1.2.7細胞免疫熒光染色 各組細胞分別計數 1×106個,轉移至帶玻璃爬片的24孔板內進行培養,72 h后棄掉培養基,并使用4%多聚甲醛固定,PBS清洗,使用10%山羊血清封閉1 h,封閉完成后使用OPN、Bmp2、Runx2一抗4 ℃孵育過夜,0.3% PBST清洗3次后使用Alexa Fluor488、Alexa Fluor594熒光二抗室溫條件下避光孵育4 h,孵育完成后使用0.3% PBST清洗3次后使用Hoechst 33342進行核復染10 min,甘油封片后使用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度。

2 結果

2.1 Adscs免疫熒光鑒定及驗證轉染效率首先,通過對Adscs以CD90進行熒光標記(圖1A),陽性率>90%,即細胞純度>90%,然后通過對各組Adscs進行Bmp2的熒光標記(圖1B),相較于對照組,成骨誘導組與Bmp2組的Bmp2基因水平顯著上調(P<0.05),說明質粒轉染成功。

圖1 脂肪干細胞熒光鑒定與轉染效率的驗證 ×400

2.2 Bmp2對Adscs成骨潛能的影響首先,通過Bmp2的mRNA與蛋白表達水平驗證誘導分化(圖2A),相較于對照組,成骨誘導組與Bmp2組的Bmp2基因水平顯著上調(P<0.05),說明誘導分化成功。相較于對照組,骨形態發生蛋白家族中Bmp4、P-Smad1/5均顯著升高(P<0.05),說明Bmp通路高度激活。而BSP、OPN、OCN、Runx2、Dlx2的表達相比對照組均顯著升高,說明Bmp通路的激活可以促進Adscs向成骨細胞方向分化(P<0.05)。在轉錄水平(圖2B-G),qRT-PCR結果顯示Bmp2及Bmp4表達水平顯著上調,說明轉染過表達Bmp2質粒效率高。相較于對照組,成骨基因BSP、OPN、OCN、Runx2以及Dlx2在過表達Bmp2后均顯著升高(P<0.05 ),說明不管是在轉錄水平還是翻譯水平,激活Bmp2信號通路均可以提高Adscs向成骨細胞分化。為了驗證實驗結果,該實驗使用皮爾遜相關性分析對Bmp2蛋白表達和成骨蛋白OPN、OCN、Dlx2、Runx2、BSP進行相關性分析(圖2H-L),結果顯示Bmp2及OPN、OCN、Dlx2、Runx2、BSP的表達呈現顯著的正相關關系,說明Bmp2過表達明確促進成骨基因表達,使Adscs向成骨細胞分化得到增強。

圖2 成骨基因的表達情況與相關性分析

2.3 Bmp2對Adscs成骨分化的影響茜素紅、堿性磷酸酶染色結果如圖所示(圖3A),過表達Bmp2后,Adscs茜素紅標記顏色顯著加深,這與陽性對照誘導骨化組趨勢一致,說明激活Bmp通路能促進Adscs的成骨分化(圖3B)。堿性磷酸酶染色結果提示(圖3C),Bmp2組有更多的硫化鈷沉淀,表明激活Bmp2通路可促使Adscs向成熟的成骨細胞轉化。

圖3 ARS與ALP染色情況

2.4 Bmp2對Adscs表達Runx2及OPN的影響為了進一步驗證Bmp2對Adscs成骨分化的影響,該研究使用Runx2及OPN進行熒光標記(圖4A),結果顯示(圖4B～C),成骨基因Runx2以及OPN在過表達Bmp2的情況下熒光強度均顯著升高(P<0.05)。

圖4 Runx2與OPN熒光染色情況

3 討論

對于骨缺損的基因療法是指把一些成骨基因轉運至靶細胞內,從而以自分泌或旁分泌的機制來促進骨形成。甚至可以多個基因一起轉染,達到內源性蛋白合成的協同調控,增強生物活性[7]。因此,能在局部維持一定生物活性因子治療濃度的基因療法被認為是未來治療骨缺損的可靠方法。在該研究中,為了證實Bmp2在體內所能發揮的成骨能力,將其轉染至Adscs中,通過堿性磷酸酶以及茜素紅染色分析顯示,Bmp2轉染后的Adscs在培養皿中硫化鈷沉淀及鈣鹽沉積增多,這表明Adscs的礦化能力增強,堿性磷酸酶、OCN和OPN是成骨早期階段的主要生物標志,而鈣沉積被認為是成骨后期的標志。Sun et al[8]通過收集豬小腸黏膜下層的細胞外基質與陶瓷骨相結合作為載體,來觀察移植的BMSCs的細胞增殖、細胞活力以及成骨分化能力,結果顯示BMSCs中成骨基因上調,并通過激活Smad1/5/8的磷酸化來實現成骨分化,這與該研究結果一致。通過Western blot 實驗顯示,其下游基因Smad1/5,表達量并沒有隨之升高,反而P-Smad1/5表達量增高,這提示Bmp2在體內的成骨能力可能是通過磷酸化Smad1/5來實現的。該實驗還檢測了Bmp4、OCN、OPN、Runx2、Dlx2、BSP這6個與成骨相關的基因表達情況,并通過qRT-PCR及免疫熒光進行了驗證,結果顯示均有不同程度的表達上調。Chen et al[9]使用氟化物誘導Bmp2低甲基化及高表達,結果顯示氟可通過Bmp2-Wnt/β-catenin通路提高OCN、Runx2、OPN的高表達,從而促進成骨細胞的增殖和分化,這與該實驗結果一致。Zhu et al[10]在來源于牙根尖乳頭的干細胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)內敲除Bmp拮抗劑GREM1來檢測OPN、OCN、BSP、Dlx2、Runx2、DSPP、OCX的表達情況,結果顯示這些基因在第1、2、3周均有增加,說明敲除GREM1能增強SCAPs的成骨/成齒分化和干性,抑制SCAPs的增殖和衰老。GREM1對SCAPs功能的影響可能是通過調節Bmp在mRNA水平上的基因表達實現的。由于實驗條件所限,未能找出更多的成骨相關基因來驗證這點。但也在一定程度上表明,Bmp2在體內的成骨作用至關重要。該研究采用電穿孔來進行轉染,屬于瞬時轉染,目前有多種供選擇的基因轉移載體,如質粒、脂質體、逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒,雖然病毒載體能夠增加轉染效率,使靶基因表達時間延長,但短效表達或許才是該研究需要的。Hsieh et al[11]指出,腺病毒作為載體來遞送Bmp基因進入細胞內是高效的方法,但短期的Bmp2高表達,已經足以啟動成骨發生的級聯反應,并且Bmp的長期高表達,也會增加成骨畸形,骨刺形成等并發癥。因此,在合適的時機選擇不同的載體,也是該研究需要考慮的。Bai et al[12]利用薄膜涂層聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和PLGA/氫氧化鎂支架開發了有效的給藥系統,使得Bmp2在需要的時候給予適當的劑量,以提高Bmp2在體內的成骨效率。

但該研究仍有一定局限,如能加入多基因進行共轉染,或能較大提高Bmp2在體內的成骨潛能,Hu et al[13]使用殼聚糖質粒共轉染Bmp2及FGF2進入Adscs中,通過PCR、Western blot、ELISA檢測顯示,共轉染后,Adscs內Bmp2、FGF2 的mRNA和蛋白水平顯著上調。與單獨轉染Bmp2或FGF2的細胞相比,共轉染組的OCN和BSP mRNA水平也顯著升高,說明共轉染能顯著促進成骨。其次,在動物實驗中進行進一步研究將會對上述結果得到更多的驗證,Vayas et al[14]在大鼠臨界顱骨缺損模型(直徑4 mm)中對Bmp2與MMP10進行研究,得出MMP10與Bmp2在成骨作用方面呈正相關,即MMP10可增強Bmp2的成骨效應,從而實現顱骨缺損修復,這提示MMP10和Bmp2的聯合應用可能成為骨缺損修復和再生的一種有前途的策略。最后值得一提的是,外泌體作為近來研究的熱點,相對Adscs而言或能提供更精準、高效的基因治療能力,因其避免了移植細胞出現的存活率低、細胞流失、受體部位致瘤性等問題。Chen et al[15]用慢病毒轉染Adscs后,從穩定過表達miR-375的Adscs中提取富含miR-375的外泌體,并用水凝膠將其包埋移植入大鼠顱骨缺損模型中,結果顯示Exo (miR-375)表現出緩慢和受控的釋放,加快了顱骨缺損的修復過程。綜上所述,Adscs治療骨缺損的前景較大,也需要投入更多的研究來為臨床治療骨缺損提供大量理論依據。