妊娠期糖尿病患者不同孕期腸道微生物和代謝產物水平變化與胰島素抵抗的關系

祝淑平，馬麗，葉曉林，顧俊菲

妊娠期糖尿病（GDM）為孕期常見并發癥，胰島素抵抗（IR）為其主要病理機制。GDM 可顯著增加羊水過多、妊娠期高血壓、產后糖尿病、新生兒窒息、巨大兒的發生風險，影響母嬰結局［1-2］。加強對GDM患者孕期IR 的研究是臨床研究重點［3-4］。機體的免疫失常及炎癥反應均與IR 有一定關系［5］，而腸道菌群在能量調節、炎癥反應及免疫功能調節中具有重要作用。正常情況下，腸道菌群與機體互利共生，腸道微生物呈平衡狀態［6］。在妊娠期間，孕婦生理變化相對顯著，隨著孕周的增加，機體腸道菌群亦隨之出現改變［7-8］。有研究認為，孕早期腸道菌群構成與未妊娠的健康女性相似，至孕晚期變形菌及放線菌門整體豐度呈增加趨勢，但個體豐度降低，孕晚期具有抗炎活性的糞便桿菌豐度亦降低［9］。另有研究提出，GDM 患者血糖異常與腸道微生物群厚壁菌、擬桿菌、放線菌門豐度改變有關，且孕婦體內微生物亦會對妊娠結局產生影響［10］。本研究對GDM 患者腸道微生物及代謝產物進行分析，探討其與孕婦IR的關系，為臨床控制GDM進展提供客觀依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018 年7 月—2021 年7 月在安徽醫科大學附屬安慶市第一人民醫院進行產檢并計劃在本院生產的120 例GDM 孕婦為研究對象。年齡18～41 歲，平均年齡（29.56±4.33）歲。GDM診斷標準：孕前無糖尿病史，口服75 g葡萄糖耐量試驗（OGTT）空腹血糖（FBG）＞5.1 mmol/L 或餐后1 h血糖＞10.0 mmol/L或餐后2 h血糖＞8.5 mmol/L［11］。納入標準：（1）GDM患者入組時孕周≤12周。（2）本地常住居民。（3）單胎妊娠。排除標準：（1）先兆流產保胎者。（2）合并凝血功能異常者。（3）合并胃腸道疾病、肝腎功能不全、甲狀腺疾病、慢性高血壓等疾病者。（4）有家族遺傳病史者。本研究經倫理委員會批準（批準號：KYLL-2018-051），并獲得所有患者知情同意。

1.2 觀察指標

1.2.1 腸道微生物檢測 分別于孕早期（1～12 周）、孕中期（13～27周）、孕晚期（28～40周）采集受試者糞便中段樣本，置入糞便收集管中，-80 ℃保存待檢。應用16S rRNA法測定樣本中生物菌群分布情況，在室溫下解凍，并提取標本中DNA，行PCR 擴增。引物515 上游：5'-GTGYCAAGCMGCCGCCGTAA-3'，806下游：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAA-3'，產物大小290 bp。純化擴增產物后應用美國Illumina 公司的HiSeq2500 PE250測序，并將結果輸入GenBank 中進行對比。微生物檢測種類包括擬桿菌屬、普氏菌屬、另枝菌屬、棲糞桿菌屬、考拉桿菌屬、毛螺菌屬、副桿菌屬、布勞特氏菌屬、厚壁菌屬、放線菌屬。

1.2.2 腸道微生物代謝產物檢測 采用液相色譜-串聯質譜法檢測糞便樣本中氧化三甲胺（TMAO）及相關代謝產物［左旋肉堿、氯化膽堿、甜菜堿、三甲胺（TMA）］。

1.2.3 IR 相關指標檢測 采用穩態模型計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）和穩態模型評估β細胞功能指數（HOMA-β）：HOMA-IR=空腹胰島素（FINS）（mU/L）×FPG（mmol/L）/22.5；HOMA-β=20×FINS（mU/L）［/FPG（mmol/L）-3.5］［12］。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0 軟件處理數據，無序分類資料采用χ2檢驗，計量資料以表示，組內計量資料比較采用配對樣本t檢驗，組間計量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間計量資料比較采用方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，腸道微生物及代謝產物與IR 指標相關性采用Pearson 相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同孕期的腸道微生物豐度變化 各孕期GDM患者普氏菌屬、另枝菌屬、考拉桿菌屬、毛螺菌屬、副桿菌屬、布勞特氏菌屬豐度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。孕早、中、晚期腸道擬桿菌屬、棲糞桿菌屬豐度依次降低，厚壁菌屬、放線菌屬豐度依次升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of gut microbes between different trimesters of pregnancy表1 不同孕期的腸道微生物豐度比較（n=120，%，）

Tab.1 Comparison of gut microbes between different trimesters of pregnancy表1 不同孕期的腸道微生物豐度比較（n=120，%，）

＊＊P＜0.01；a與孕早期比較，b與孕中期比較，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F擬桿菌屬35.25±3.64 27.58±3.14a 25.69±5.24ab 182.485＊＊普氏菌屬6.11±0.63 6.12±0.78 6.19±0.81 0.412另枝菌屬2.43±0.22 2.46±0.28 2.47±0.39 0.094棲糞桿菌屬11.69±1.42 9.71±0.98a 6.75±0.71ab 639.242＊＊考拉桿菌屬8.47±0.85 8.66±0.87 8.59±0.82 1.545孕期孕早期孕中期孕晚期F毛螺菌屬4.83±0.45 4.87±0.52 4.92±0.71 0.749副桿菌屬1.13±0.12 1.12±0.17 1.15±0.18 1.110布勞特氏菌屬0.35±0.07 0.34±0.07 0.33±0.07 2.449厚壁菌屬2.36±0.45 3.16±0.38a 4.17±0.48ab 513.03＊＊放線菌屬9.05±2.01 10.36±1.58a 13.26±1.54ab 187.583＊＊

2.2 不同孕期腸道微生物代謝產物水平比較 不同孕期左旋肉堿、氯化膽堿、甜菜堿水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），孕早、中、晚期GDM 患者腸道TMAO 和TMA 水平依次升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of metabolites between different trimesters of pregnancy表2 不同孕期腸道微生物代謝產物水平比較（n=120，mmol/L，）

Tab.2 Comparison of metabolites between different trimesters of pregnancy表2 不同孕期腸道微生物代謝產物水平比較（n=120，mmol/L，）

＊＊P＜0.01；a與孕早期比較，b與孕中期比較，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F TMAO 8.26±2.35 10.58±2.71a 12.36±2.54ab 78.768＊＊TMA 181.23±19.58 234.16±30.15a 297.41±30.29ab 551.159＊＊左旋肉堿122.36±25.29 120.54±27.21 127.36±26.57 2.152氯化膽堿113.26±25.87 120.37±25.69 119.64±29.33 2.515甜菜堿225.36±37.21 226.47±38.45 231.36±35.47 0.890

2.3 不同孕期胰島素抵抗水平分析 孕早、中、晚期GDM 患者HOMA-IR 依次升高，HOMA-β 依次下降（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of insulin resistance between different trimesters of pregnancy表3 不同孕期胰島素抵抗水平比較（n=120，）

Tab.3 Comparison of insulin resistance between different trimesters of pregnancy表3 不同孕期胰島素抵抗水平比較（n=120，）

＊＊P＜0.01；a與孕早期比較，b與孕中期比較，P＜0.05。

孕期孕早期孕中期孕晚期F HOMA-IR 1.25±0.23 1.69±0.17a 3.58±0.39ab 2 358.598＊＊HOMA-β 67.25±7.19 36.54±5.44a 21.36±3.58ab 2 090.892＊＊

2.4 孕晚期腸道微生物及代謝產物與IR 的相關性 孕晚期擬桿菌屬、棲糞桿菌屬與HOMA-IR 呈負相關（r 分別為-0.564、-0.617，均P＜0.05），與HOMA-β 呈正相關（r分別為0.378、0.475，均P＜0.05）；厚壁菌屬、放線菌屬、TMAO、TMA 與HOMAIR 呈正相關（r分別為0.425、0.417、0.681、0.526，均P＜0.05），與HOMA-β 呈負相關（r分別為-0.621、-0.395、-0.533、-0.647，均P＜0.05）。

3 討論

IR 為妊娠期代謝系統常見生理性變化，隨著孕周的增大，機體中雌激素和孕激素的增加可拮抗胰島素，并降低機體靶器官對胰島素的敏感性。在正常情況下，機體可代償性分泌胰島素控制血糖水平，而GDM患者無法分泌足量胰島素控制血糖水平，出現糖脂代謝紊亂，誘發IR，而IR 亦會加重糖脂代謝紊亂，形成惡性循環，危害母嬰安全［13-14］。近年來研究發現，腸道菌群失調會加重機體糖脂代謝紊亂，加重糖尿病病情［15-16］，但較少研究分析腸道菌群與IR的關系。

腸道菌群失調后，機體會快速吸收脂肪酸及葡萄糖，促進脂肪細胞因子大量分泌，刺激免疫系統、誘導分解代謝途徑均會增加體質量，加重糖尿病癥狀，糖脂代謝異常亦會在一定程度上影響機體腸道菌群平衡［17］。腸道菌落種類較多，在消化系統中功效不盡相同，厚壁桿菌、棲糞桿菌、放線菌、擬桿菌是腸道中相對優勢的細菌。本研究對不同孕期腸道菌群微生物進行分析發現，孕早、中、晚期腸道的擬桿菌屬、棲糞桿菌屬豐度依次降低，厚壁菌屬、放線菌屬豐度依次升高，提示隨著孕周的增加，GDM 孕婦腸道菌群失調越發嚴重。分析可能是因為厚壁桿菌、放線菌產生的丁酸鹽細菌無法被宿主吸收，其水平越低，宿主吸收能力越強，而在GDM孕婦中，糖脂代謝異常亦會影響機體吸收能力，因此厚壁桿菌、放線菌水平升高［18］。棲糞桿菌可有效維持腸黏膜屏障完整性，機體在出現腸道功能紊亂時，其水平亦顯著降低［19］。擬桿菌參與多糖、類固醇、膽汁酸的代謝，還可維持腸道正常生理，但GDM孕婦糖脂代謝異常則會進一步影響多糖、類固醇、膽汁酸的代謝，降低擬桿菌水平［20］。放線菌可產生各種活性物質，改善腸道上皮屏障功能，因此在機體腸道功能受損后，其水平降低［21］。但在本研究中呈升高趨勢，可能受到環境、研究對象腸道功能影響，對此需擴大樣本量進行驗證。

TMAO、TMA為腸源性菌群代謝產物，腸道中部分菌群可產生TMA 裂解酶，將飲食中攝入的肉類堿、甜菜堿、膽堿轉化為TMA，經黃素單加氧酶氧化生成TMAO，調節蛋白質穩定性及活性，TMAO、TMA水平的高低亦可在一定程度上反映機體腸道功能［22］。本研究發現，孕早、中、晚期GDM 患者腸道TMAO、TMA 水平依次升高，提示隨著孕期增加，GDM 孕婦腸道微生物代謝產物亦出現異常。分析可能是因為GDM在出現腸道菌群失調后，腸道上皮細胞間緊密性降低，導致腸道滲透性增加，腸道菌群及代謝產物則從腸腔轉移至循環系統，加重病情，而作為腸源性菌群代謝產物的TMAO、TMA 水平在菌群失調后亦受到影響［6］。本研究還發現，孕早、中、晚期GDM 患者HOMA-IR 依次升高，HOMA-β 依次下降；同時孕晚期腸道內擬桿菌屬、棲糞桿菌屬與HOMA-IR 呈負相關，與HOMA-β呈正相關；厚壁菌屬、放線菌屬、TMAO、TMA 與HOMA-IR 呈正相關，與HOMA-β呈負相關，提示機體中腸道微生物及代謝產物水平與GDM 孕婦IR 存在一定關系。分析原因可能是機體中腸道菌群失調影響了代謝產物的合成及代謝，機體中腸道屏障亦受損，增加局部腸道滲透性，加重炎癥反應，誘發代謝紊亂，進一步誘導內質網鈣庫中細胞內鈣動員，刺激內質網應激，而內質網應激則可通過鈣依賴蛋白激酶Ⅱ激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK），JNK水平升高亦可促進胰島素受體底物絲氨酸磷酸化，降低機體蛋白激酶B 磷酸化水平，抑制機體中胰島素信號傳導，加重IR［23-24］。

綜上所述，隨著孕期進展，GDM 孕婦腸道微生物及代謝產物水平紊亂會增加GDM 孕婦發生IR 風險。但本研究不足之處在于研究例數較少，得出結論或可存在偏差，因此還需擴大樣本量進行驗證。