高效液相色譜法測(cè)定柑桔蜜餞胭脂紅的不確定度

李嘉鴻，詹月梅，羅慈婷

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

胭脂紅是我國(guó)使用最廣泛、用量最大的一種水溶液偶氮類人工合成色素。按我國(guó)規(guī)定可用于涼果蜜餞、配制酒、果汁飲料、糕點(diǎn)、果凍和果醬等，不能用于肉干、肉脯制品、水產(chǎn)制品等食品中。天然色素穩(wěn)定性較差、著色不均勻，人工合成色素胭脂紅色彩鮮艷、著色力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、品質(zhì)均一且成本低廉，因此被廣泛應(yīng)用于食品著色。毒理實(shí)驗(yàn)顯示胭脂紅在人體代謝過程中可產(chǎn)生致癌性物質(zhì)，有一定的致突變作用，加工過程殘留的污染物也對(duì)人體有潛在危害，使用應(yīng)遵循我國(guó)的食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定[1]。

涼果蜜餞類品種繁多、口感獨(dú)特、各具風(fēng)味，深得大眾的喜愛。隨著生活水平的提高和現(xiàn)代文明的發(fā)展，人們對(duì)食品安全問題也越發(fā)關(guān)注。關(guān)注食品安全的同時(shí)，消費(fèi)者在購(gòu)買商品時(shí)也更偏愛質(zhì)量更好的產(chǎn)品，一般是通過顏色品相判定涼果蜜餞類的新鮮程度和質(zhì)量好壞。加工或儲(chǔ)存過程中，在氧及酶的作用下涼果蜜餞易產(chǎn)生色變，導(dǎo)致原料顏色受損，從而影響涼果蜜餞成品色澤。部分生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)為增加產(chǎn)品品相使產(chǎn)品的色澤好看，或彌補(bǔ)原料品質(zhì)較低而超范圍、超限量使用色素，導(dǎo)致色素含量超標(biāo)[2]。本文按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測(cè)定》（GB 5009.35—2016）的檢驗(yàn)要求，結(jié)合《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006：2019）分析影響測(cè)定柑桔蜜餞中胭脂紅含量的不確定度的因素。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與儀器

液相色譜儀Agilent 1260 Infinity Ⅱ（二極管陣列檢測(cè)器）；十萬分之一天平；千分之一天平；超聲波清洗機(jī)；恒溫水浴鍋。

1.2 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)品（壇墨質(zhì)檢科技股份責(zé)任公司，濃度為1 000 μg·mL-1）；檸檬酸；聚酰胺粉；甲醇（色譜純）；甲酸；無水乙醇；氨水；乙酸。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取待測(cè)試樣，置于100 mL 燒杯中，加入30 mL蒸餾水，溫?zé)崾蛊淙芙?，若試樣溶液pH 值較高，加入檸檬酸溶液使pH 值降至6，試樣溶液水浴加熱至60 ℃，1 g 聚酰胺粉加入少量蒸餾水調(diào)至黏稠，緩緩倒入試樣溶液中并攪拌，使用G3 垂融漏斗減壓過濾，按順序先后分別用60 ℃ pH 值為4 的水、甲醇-甲酸溶液（體積比6 ∶4）各洗滌5 次，再用蒸餾水洗至中性，最后用無水乙醇-氨水-水溶液（體積比7 ∶2 ∶1）解吸5 次，至色素完全解吸后收集提取液，加入乙酸中和pH，蒸至近干，加蒸餾水定容至 5 mL，充分混勻，移取定容液500 μL，加蒸餾水定容至1.00 mL，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，進(jìn)HPLC儀分析[3]。

1.3.2 儀器條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+0.02 mol·L-1乙酰胺溶液（梯度洗脫）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)：428 nm；進(jìn)樣量：10.0 μL。

1.3.3 數(shù)學(xué)模型試樣中胭脂紅含量的計(jì)算公式為

式中：X為試樣中胭脂紅含量，g·kg-1；C為進(jìn)樣液胭脂紅濃度，μg·mL-1；V1為試樣定容體積，mL；V2為試樣定容后再稀釋吸取體積，mL；V3為試樣最終定容體積，mL；m樣為試樣質(zhì)量，g；1 000 為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從數(shù)學(xué)模型及測(cè)試過程的主要步驟分析，測(cè)定柑桔蜜餞中胭脂紅含量的不確定度主要來源于以下5方面：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；②試樣稱量；③試樣定容體積；④線性最小二乘法求樣品濃度；⑤重復(fù)性條件下，進(jìn)行兩次測(cè)量的結(jié)果重復(fù)性。具體見圖1。

圖1 胭脂紅含量的不確定度來源

2.2 不確定度計(jì)算

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由壇墨質(zhì)檢科技股份責(zé)任公司提供，該標(biāo)物由證書提供信息可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1 000 μg·mL-1，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2%，為正態(tài)分布，包含因子k=2，則引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 試樣稱量引入的不確定度

根據(jù)GB 5009.35—2016 的檢驗(yàn)要求，使用千分之一電子天平稱取混勻的待測(cè)試樣5 g（精確至0.001 g），由檢定證書給出該電子天平的稱量范圍為0 ～50 g（0 ～5 000 e，e=10 d，d=1 mg），最大允許誤差MPE=±5 mg，按均勻分布k1= 3，用5 g標(biāo)準(zhǔn)砝碼校正天平，由檢定證書給出該砝碼的擴(kuò)展不確度為U1=0.03 mg，k2=2，用該天平稱取一份柑桔蜜餞試樣6 次，得到結(jié)果分別為5.063 g、5.063 g、5.063 g、5.062 g、5.062 g 和5.063 g，計(jì)算得均值為5.063 g，方差S2=0.000 000 267。則引入的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 試樣定容體積引入的不確定度

（1）試樣定容體積引入的不確定度。試樣經(jīng)前處理后，移至5 mL A 級(jí)單標(biāo)線容量瓶中，加蒸餾水至容積刻度線定容，從《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）表6 查得5 mL A 級(jí)單標(biāo)線容量瓶的容量允差為±0.020 mL[4]，按均勻分布k= 3，則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

在溫度20 ℃條件下校準(zhǔn)容量瓶，實(shí)驗(yàn)室溫度變化為（20±5）℃。校準(zhǔn)過程中產(chǎn)生的不確定度可通過體積膨脹系數(shù)和溫度波動(dòng)范圍進(jìn)行估算。因環(huán)境溫度引起的體積形態(tài)變化較小忽略不計(jì)，只需考慮玻璃量器體積膨脹的影響。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，因此產(chǎn)生的體積偏差為V1×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均勻分布k= 3，由環(huán)境溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試樣定容體積引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）試樣定容后再稀釋移取體積引入的不確定度。由于胭脂紅的檢出濃度超出曲線范圍，需要稀釋后再進(jìn)樣。吸取500 μL 試樣定容液過程中，由《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）表1 可知1 000 μL移液器500 μL 檢定點(diǎn)的容量允許誤差為±1.0%[5]，按均勻分布k= 3，則引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表1 濃度和峰面積測(cè)定結(jié)果

在溫度20 ℃條件下校準(zhǔn)移液器，實(shí)驗(yàn)室溫度變化為（20±5）℃。校準(zhǔn)過程中產(chǎn)生的不確定度可通過體積膨脹和溫度波動(dòng)范圍進(jìn)行估算。因環(huán)境溫度引起的體積形態(tài)變化較小忽略不計(jì)，只需考慮玻璃量器體積膨脹的影響。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，因此產(chǎn)生的體積偏差為V2×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均勻分布，k= 3，由環(huán)境溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試樣定容后再稀釋移取體積引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）試樣最終定容體積引入的不確定度。用1 mL A 級(jí)單標(biāo)線容量瓶定容的過程中，從《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）表6 可知1 mL A 級(jí)單標(biāo)線容量瓶的容量允差為±0.010 mL[4]，按均勻分布k= 3，則引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

在溫度20 ℃條件下校準(zhǔn)容量瓶，實(shí)驗(yàn)室溫度變化為（20±5）℃。校準(zhǔn)過程中產(chǎn)生的不確定度可通過體積膨脹和溫度波動(dòng)范圍來估算。因環(huán)境溫度引起的體積形態(tài)變化較小忽略不計(jì)，只需考慮玻璃量器體積膨脹的影響。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，因此產(chǎn)生的體積偏差為V3×10 ℃×2.1×10-4℃-1，按均勻分布，k= 3，由環(huán)境溫度變化引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試樣最終定容體積引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

因此，試樣定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 線性最小二乘法求樣品濃度引入的不確定度

通過校準(zhǔn)曲線求出試樣中胭脂紅的濃度，按梯度濃度配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.20 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、100.00 μg·mL-1，平均值c—標(biāo)=32.24 μg·mL-1，各個(gè)點(diǎn)分別進(jìn)行3 次分析，峰面積測(cè)定結(jié)果見表1。以胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x）和對(duì)應(yīng)峰面積（y）進(jìn)行線性回歸方程擬合[6]，結(jié)果見表2。

表2 線性最小二乘法擬合結(jié)果和檢出限

線性最小二乘法的殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差S為

式中：a為截距；b為斜率；cj為胭脂紅濃度點(diǎn)，μg·mL-1；n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)；Aj為胭脂紅濃度對(duì)應(yīng)峰面積。

對(duì)胭脂紅浸出溶液進(jìn)行兩次測(cè)量，測(cè)得濃度為46.23 μg·mL-1、45.87 μg·mL-1，得到濃度平均值為c=46.05 μg·mL-1，則由線性最小二乘法求試樣濃度產(chǎn)生的不確定度為

線性最小二乘法求試樣濃度產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

操作人員、讀數(shù)偏差、試樣均勻程度和測(cè)量?jī)x器的變動(dòng)等是對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響的主要因素[7]。在測(cè)量重復(fù)性條件下，對(duì)一系列重復(fù)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得到測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度。

在測(cè)量重復(fù)性條件下，使用同一臺(tái)實(shí)驗(yàn)儀器對(duì)待測(cè)樣品柑桔蜜餞進(jìn)行2 次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，測(cè)得胭脂紅含量為0.091 3 g·kg-1、0.090 3 g·kg-1，平均值為0.091 g·kg-1，采用極差法評(píng)定獲得實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差，依照J(rèn)JF 1059.1—2012 表1 查得極差系數(shù)C為1.13[7]，測(cè)量的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

匯總以上5 個(gè)主要來源引入的不確定度，得出柑桔蜜餞中胭脂紅含量檢驗(yàn)過程的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

置信區(qū)間在95%時(shí)，包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為

試樣中胭脂紅含量的測(cè)定結(jié)果為0.091 g·kg-1，則其擴(kuò)展不確定度為

3 結(jié)論

本文研究得出，柑桔蜜餞中胭脂紅含量的測(cè)定結(jié)果為0.091 g·kg-1，在95%置信區(qū)間下，其擴(kuò)展不確定度為0.003 g·kg-1（k=2）。各個(gè)環(huán)節(jié)均對(duì)測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響，可通過提高試樣的均勻性以及檢驗(yàn)人員的操作能力等增進(jìn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。