腹瀉病例中5 種致瀉性大腸埃希菌的分子分型研究

王雪梅，張 苗

（淄博市疾病預防控制中心，山東淄博 255206）

大腸埃希氏菌是人體的正常菌群，后來人們發(fā)現某些大腸埃希菌可引起腹瀉并在人群中流行，稱為致瀉大腸埃希菌（DiarrheagenicEscherichia coli，DEC）。20 世紀90 年代，DEC 被列為食品中致病菌之首[1]。根據攜帶毒力基因的不同，分為腸集聚黏附性大腸埃希菌（EnteroadherentEscherichia coli，EAEC）、腸道致病性大腸埃希菌（EnteropathogenicEscherichia coli，EPEC）、腸產毒性大腸埃希菌（EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）、 腸 道侵襲性大腸埃希菌（EnterinvasiveEscherichia coli，EIEC）和腸出血性大腸埃希菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）[2]。脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型主要用于病原體的溯源研究，其原理是用瓊脂塊將細菌包埋，選取適合的內切酶進行酶切，使酶切片段在電泳中通過變換電場方向而得到良好的分離。本研究通過對腹瀉人群分離的DEC 進行PFGE 分子分型，旨在了解腹瀉患者DEC 感染的菌株間基因型聯系和差異，為DEC 的防控及分子分型的數據庫提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株為腹瀉病例糞便中分離的DEC 92 株。PCR、PFGE 分別以5 種致瀉大腸標準菌株和布倫登盧普沙門菌H9812 作為質控菌株。

麥康凱平板（北京路橋）；營養(yǎng)瓊脂（北京路橋）；血瓊脂平板（北京路橋）；核酸提取試劑盒（蘇州天隆）；致瀉性大腸埃希菌多重PCR 檢測試劑盒（卓誠惠生）；全自動毛細管電泳試劑盒（卓誠惠生）；XbaI（TaKaRa 生物公司）。

1.2 儀器與設備

核 酸提 取 儀（NP968，蘇 州 天 隆）；PCR 儀（Mastercycler gradient，eppendorf 公司）；多重食源性致病菌核酸檢測系統(tǒng)（PathoMPSTM，凱杰公司）；恒溫振蕩水浴搖床（DSHZ-300A，太倉市實驗設備廠）；脈沖場電泳儀（CHEF Mapper XA，Bio-Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR+，Bio-Rad 公司）。

1.3 實驗方法

（1）將可疑DEC 劃線麥康凱平板進行分離培養(yǎng)，挑取可疑菌落，劃線營養(yǎng)瓊脂后進行PCR 毒力基因檢測，根據所攜帶的毒力基因進行型別鑒定。

（2）將菌落劃線血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)14～18 h。將細菌均勻懸浮于配制好的CSB 中制成4.0 ～4.5 麥氏單位的菌懸液，加入20 mg·mL-1蛋白酶K 后加1%瓊脂糖，待其凝固制成小膠塊，水浴搖床150 r·min-1左右溫育2 h。用無菌超純水洗2 次，再用TE 緩沖液洗滌4 次。

（3）用內切酶XbaI Ⅰ對切成2 mm 的小膠塊進行酶切，酶切時間至少2 h。將酶切后的膠塊置于梳子上，倒入1%瓊脂糖，冷卻后放入電泳儀電泳19 h。

（4）將電泳后的膠塊取出用GelRed 染液染色，純水清洗后，凝膠成像儀獲取圖像，用 BioNumerics軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 患者發(fā)病年齡分布

0 ～12 歲患者檢出15 例，占16.30%；13 ～44歲患者檢出60 例，占65.22%；45 ～59 歲患者檢出9 例，占9.78%；≥60 歲患者檢出8 例，占8.70%，見表1。

表1 患者發(fā)病年齡分布

2.2 PFGE 分子分型

對92 株攜帶毒力基因的DEC 進行PFGE 分子分型，相似度最高為100%，最低的只有9.36%，主要結果見圖1。

圖1 部分DEC 分子分型結果

3 討論?

據WHO 統(tǒng)計，全球每年約有20 億感染性腹瀉患者。感染性腹瀉已成為全球性重要公共衛(wèi)生問題，僅在2000 年腹瀉引起的死亡報告數就達到210 萬例[3]。DEC 是引起腹瀉的主要病原菌之一，從腹瀉患者中分離的比例呈上升趨勢。有研究顯示，DEC感染在細菌性感染腹瀉中居首位[4]。

通過對DEC 患者進行年齡段分析，結果表明，13 ～44 歲患者DEC 的檢出率較高，可能與該年齡段外出就餐頻繁，同時對食品衛(wèi)生重視程度不高有關，因此在加強食品監(jiān)管的同時也要做好食品衛(wèi)生安全的健康教育。本文研究結果與相關文獻中的結果基本相符[5]，與河南省5 歲以下兒童為高發(fā)人群的結果不符[6]。

目前常用的分子分型技術主要有mPCR 技術、重復序列PCR 技術、PFGE 技術。mPCR 是在同一個反應體系中加入一對以上引物，分別擴增不同的模板，得到不同的目的片段[7]。重復序列PCR 技術是一種細菌基因組指紋分析方法，是擴增細菌基因組中的短重復序列，主要通過比較電泳條帶，分析基因組間的差異[8]。PFGE 是PulseNet China 重要的病原菌分型技術，可實現全球監(jiān)測結果的比對[9]。PFGE 是細菌分子分型技術的“金標準”，通過比較菌株之間PFGE 圖譜條帶分析菌株間同源性和相關性[10]。TALON 等[11]提出細菌條帶相似度在85%以上為同源克隆菌株。運用PFGE 技術對腹瀉病例中檢出的DEC 菌株進行同源性分析，并對相關病例進行流行病學調查，判斷是否發(fā)生流行，可提高疾病預警能力[12]。

本研究選取腹瀉病人糞便中分離的大腸埃希氏菌，通過毛細管電泳儀檢測其毒力基因，共檢出DEC 92 株， 其 中EAEC 60 株、ETEC 20 株、EPEC 10 株，EHEC、EIEC 各1 株。此次檢測發(fā)現，4 株ETEC 細菌條帶的相似度為100%。其中3 株來自2017 年在同一醫(yī)院就診的3 名病例，1 株來自2016年在此醫(yī)院就診的病例。在不同時間不同患者中檢出同一帶型的ETEC，有報道稱可能會存在部分菌株因其遺傳特性比較穩(wěn)定，在環(huán)境中長期存在[13]。另外，2 株來自同一病例攜帶不同毒力基因組合的EAEC，DNA 條帶相似度為100%。檢測的大多數菌株的條帶相似度低于85%，說明由DEC 引起患者腹瀉的菌株，其基因型存在多態(tài)性，以散發(fā)病例為主。

綜上所述，通過對腹瀉病例中分離的DEC 進行PFGE 分子分型，為DEC 病例的監(jiān)測和控制提供參考數據，為深入研究DEC 分子多樣性提供基礎，為DEC 導致腹瀉的分子流行病學研究提供依據，對暴發(fā)預警及溯源調查具有重要意義。