蜂蜜植物源毒性成分檢測技術研究進展

劉珈伶，韋 環

（廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西南寧 530022）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質。蜂蜜除含有大量葡萄糖、果糖等糖類物質外，還富含維生素、蛋白質及有機酸等營養成分[1]。其具有抑菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節等作用[2-3]，是深受公眾喜愛的藥食同源食物。隨著人們對蜂產品需求量的不斷增加，蜂蜜質量安全問題引發大眾關注，食用蜂蜜中毒惡性事件引發了民眾恐慌。蜂蜜本無毒，但在生產過程中被污染或蜜蜂采集有毒花蜜釀制的蜂蜜，可能會引起中毒[4-5]。我國廣西、云南和貴州等地均有食用有毒蜂蜜而引發食源性疾病的報道[6-7]。食用有毒蜂蜜后會引發如頭暈頭疼、嘔吐腹瀉、四肢麻木、呼吸中樞麻痹等中毒癥狀[5-7]，甚至引發休克死亡，據統計野生蜂蜜引發中毒的死亡率在20%以上[8-9]。

蜂蜜有毒物質主要來源于蜜蜂采集有毒蜜源植物花粉。《食品安全國家標準 蜂蜜》（GB 14963—2011）中規定“蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應安全無毒，不得來源于雷公藤、博落回、狼毒等有毒蜜源植物”。但標準未列出具體植物源毒性成分和相關檢測方法。國內對有毒蜜源植物如雷公藤屬、博落回屬和鉤吻屬等毒性成分關注和研究較多[10-12]。但我國地大物博，除了上述有毒蜜源植物之外，還有毛茛科的烏頭屬、百合科的藜蘆屬和茄科的曼陀羅屬等多種毒性較高的毒源植物[5]。要預防和控制此類事件發生，快速準確檢測出蜂蜜中植物源毒性成分十分重要。本文梳理了近年來報道的蜂蜜中主要的植物源毒性成分，對其前處理方法和檢測技術的特點和研究進展進行了綜述，以期為提高蜂蜜中植物源毒性成分監測水平提供幫助，助推蜂產業的高質量發展。

1 蜂蜜中的植物源毒性成分及其分類

含有天然毒素成分的植物種類繁多，毒性成分和中毒臨床表現各異。生物堿和萜類化合物是最常見的天然毒素。生物堿（Alkaloid）是存在于自然界中的一類堿性含氮有機化合物，結構多變，數量龐大，目前已發現的天然生物堿化合物就有2 萬種以上[13]。分布最廣的為吡咯里西啶生物堿（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs），目前已發現超過600 多個不同結構的PAs 及其N-氧化物，存在于世界各地的6 000多種植物中，大部分PAs 對人體肝臟有毒[14]。萜類化合物（Terpenoids）是自然界中分布廣泛的天然產物之一，雙環倍半萜內酯類、二萜皂苷類和松香烷型二萜等是蜂蜜植物源毒性成分的來源。植物源毒性成分的化學結構復雜多變，增加了研究難度。本文梳理了近年來國內外文獻報道的有關蜂蜜植物源毒性化合物，并按結構進行分類，如表1 所示。

表1 蜂蜜中植物源毒性化合物名稱及分子式信息

由表1 可見，已報道的毒性物質中PAs 及其N-氧化物占近五成，其次是具有中樞神經毒性的二萜類和吲哚類生物堿。這些毒性化合物毒性大，中毒癥狀急，致死率高，是研究的重點。對于數目龐大的PAs 要逐一制定安全限量并不科學，歐盟2020 年新修訂的（EC）No. 1881/2006 以21 種PAs 總和正式設定了花粉等部分食品中PAs 的限量。盡管未涉及蜂蜜，但為開展蜂蜜中毒性物質研究和制定合理限值提供了思路。

2 蜂蜜中植物源毒性成分的前處理

蜂蜜糖分高、黏度大、基質干擾強，樣品前處理技術成為準確檢測毒性成分的關鍵。傳統前處理技術有溶劑提取法、液液萃取法等，普遍存在操作步驟煩瑣、有機溶劑消耗量大、凈化能力弱等缺點。隨著前處理技術的迅速發展，固相萃取、加速溶劑萃取、頂空固相微萃取等新興技術在蜂蜜植物源毒性成分檢測中獲得了良好的應用。本文重點介紹應用最為廣泛的固相萃取技術，包括分散固相萃取法、磁性固相萃取法、離子交換固相萃取法等。

2.1 分散固相萃取

分散固相萃取技術也稱QuEChERS，簡便快捷，操作方便，應用廣泛。PAs 的N-氧化物極性較大，為便于后期分析需要用鋅粉在凈化時還原成游離的PAs[19,29]。還原法提高了PAs 含量，增加了檢測靈敏度，同時減少了PAs N-氧化物標準物質的使用，某些無標準物質的N-氧化物也能被檢測到。在進行廣譜篩查時，常采用如NaCl+PSA 的簡易QuEChERS法，減少吸附劑復雜造成的損失[12]。QuEChERS 法可以根據凈化目標物不同，選擇適宜的分散劑。例如，中性氧化鋁適合芳香胺類化合物的萃取，張元元等[30]使用中性氧化鋁提取雷公藤甲素。石墨化炭黑（Graphitized Carbon Blacks，GCB）對于平面分子或者含有平面芳香環的分子具有強烈的吸附作用，ROMERA-TORRES 等[25]使 用GCB 提 取 蜂 蜜 中9 種莨菪烷類生物堿。QuEChERS 法靈活便捷，已在蜂蜜基質中多種植物毒素的廣譜性提取凈化中得到廣泛開發和研究，專屬性依凈化目標物的不同予以調整。

2.2 磁性固相萃取

磁性固相萃取是以功能化超順磁性納米粒子（Magnetic Nanoparticles，MNPs）為吸附材料，只需要一個外部磁場即可從各種溶液基質中分離目標物。該方法簡單快捷，易操作，專屬性強，適用于分離復雜基質中的痕量目標物。段蘇然等[31]采用MNPs改良了QuEChERS 技術凈化，提取蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤甲素，減少了因PSA 吸附造成的損失和C18對雷公藤甲素電負性的影響。

2.3 離子交換固相萃取

離子交換固相萃取適用于帶電化合物，大部分生物堿帶正電荷，混合型陽離子交換固相萃取（MCX）[4,22]和強陽離子交換固相萃取（SCX）[15,17,20]電負性強，易發生陽離子交換。MCX 能提供反相吸附和陽離子交換雙重作用力，對堿性物質保留能力更強，在生物堿中應用更廣。使用MCX 提取PAs 時常以稀酸-甲醇為溶劑[22]，但馬桑亭類、鬧羊花類毒素等會因甲醇共流出而損失。為兼顧更多生物堿，韋環等[4]將溶劑換為水，在PAs、馬桑亭和鬧羊花等20 種不同類別植物毒素的凈化中得到較好應用。

3 蜂蜜中植物源毒性成分的檢測技術

蜂蜜的植物源毒性成分種類多，毒源范圍廣，各種化合物結構復雜，同分異構體多，檢測難度大。其檢測方法主要包括基于視覺感官檢測的蜂蜜孢粉學[11,21-22]、色譜檢測技術和酶聯免疫吸附技術[18]等。蜂蜜孢粉學能提供蜜源信息，但無法對毒性物質定

性和定量。酶聯免疫吸附技術需要抗原與抗體有特異反應，目前還無法達到多有毒物質同時檢測。色譜技術具有強大分離功能，操作方便，條件溫和，方法多樣，使得多毒素同時定性定量成為可能。薄層色譜法是簡單的色譜分析方法，操作簡便，早期也用于快速檢測植物毒素，但靈敏度不高，分離能力有限，對部分毒性物質的專一性不夠，目前已被其他分離能力更高的技術所取代。

3.1 高效液相色譜法

高 效 液 相 色 譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是用于分析高沸點不易揮發的、熱不穩定有機化合物的重要分離分析技術。一般采用C18作為分離柱，甲醇/乙腈-水作為流動相檢測蜂蜜中的植物毒素[11,21]。降低柱溫對分離有利，HUNGERFORD 等[15]使用5 ℃的低溫HPLC 實現昆士蘭蜂蜜中Indicine 和Lycopsamine 兩種PAs 的立體異構體分離。HPLC 與二極管陣列檢測器（Photo-Diode Array，PDA）聯用時，可得任意時間的光譜圖，相當于與紫外聯用[21]。但HPLC 基質干擾嚴重，靈敏度不足，因此逐步被色譜質譜聯用技術所取代。

3.2 氣相色譜串聯質譜法

氣相色譜串聯質譜（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）適宜分析小分子、易揮發、熱穩定的化合物，商業化的質譜數據庫檢索功能實現了未知/已知物的定性。GC-MS 對目標物分子量和熱穩定性要求高，部分毒性物質的質譜數據庫匹配度低，部分數據庫中缺乏對應信息的N-氧化物，定性困難。

3.3 超高效液相色譜串聯質譜法

超高效液相色譜串聯質譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）的質譜一般是指低分辨率的四極桿（QQQ）和離子阱（Trap）質譜。它對高沸點、不揮發和熱不穩定化合物在定性、定量分析方面具有特殊優勢，是蜂蜜中毒性物質檢測最通用和最有用的方法。大氣壓電離化學電離離子源（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）不能生成一系列多電荷離子，一般用于弱極性、小分子有機物。如PAs 的N-氧化物極性強，需要還原后使用APCI 源檢測蜂蜜中PAs 總量[20]。ESI 源是主要的離子源，多位學者建立了ESI 模式下，采用多反應監測（MRM）測定PAs、雷公藤毒素、馬桑毒素的定量方法[19,27,31]。離子阱質譜可得到多級質譜離子碎片，用于推導未知化合物結構。SIXTO 等[16]采用3 種離子檢測模式在沒有分析標準的情況下定性和定量蜂蜜中毒性最大的PAs。低分辨率質譜雖然痕量分析準確，但基質干擾嚴重，不能有效區分目標化合物和干擾化合物，存在假陽性。

3.4 超高效液相色譜-高分辨質譜法

高分辨 質 譜（High Resolution Mass Spectrum，HRMS）提供的精確質量信息可以用來確定離子峰的元素組成，比低分辨質譜儀定性結果更準確，靈敏度更高，類型包括四極桿飛行時間串聯質譜（Triple Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometer，Q-TOF MS）、 靜 電 軌 道 阱 質 譜（Orbitrap Mass Spectrometer，Orbitrap MS）、傅立葉變換質譜等。其中，傅立葉變換質譜價格高昂難操作，應用少。Q-TOF MS 和Orbitrap MS 分辨能力和價格同比略低，但質量范圍寬、掃描速度快、維護簡單，是最常見、普及最廣的高分辨質譜。超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF MS）可提供瞬時高精度全譜譜圖，信息量全。相較而言TOF MS 分辨率較低，質量穩定性較差，需與其他串級質譜聯用才能實現多級質譜功能，用于鑒別未知分析物[23]。靜電軌道離子阱質譜（Orbitrap MS）是一種基于靜電場電磁理論的新型高分辨質量分析器，已經在藥物、食品、環境等領域廣泛應用。相比Q-TOF MS，該方法能提供更高的質量精度和穩定性，但采集速率較低，在高速掃描時，分辨率會顯著下降。常用掃描模式為全掃描/數據依賴性二級掃描（Full MS/ddMS2），即單個分析周期獲得精確質量的一級、二級質譜。以已知毒物的精準特征離子質譜信息建立專屬數據庫，可實現無標準品的非靶向篩查[4,15,17]。Orbitrap MS 的Targeted-SIM 采集模式還有媲美四極桿質譜的定量能力。甘源等[10]以此建立蜂蜜中5 種雷公藤毒素的高分辨質譜定量分析方法。Orbitrap MS 強大的數據庫、高質量的質譜圖，可輕松實現定性和定量。

4 結語

蜂蜜中毒事件偶發性高、致死率高、危害性強。目前食品安全國家標準僅列舉了幾種毒性較大的蜜源植物名稱，未明確主要毒性成分及其檢測方法。植物源毒性物質來源廣、種類多、結構復雜，使得植物源毒性成分檢測和研究面臨巨大的挑戰。目前已經發現并建立了上百種物質的鑒定檢測方法，但自然界中有毒物質遠遠不止這些，新的毒性物質亟待去發現和研究。QuEChERs、MCX、MNPs 等高效固相萃取技術在樣品預處理中發揮越來越大的作用。QuEChERS 適于大量樣品的批量前處理需求，可與多種固相萃取技術靈活結合，提高專屬性。MCX 對堿性和中性化合物有很好的選擇性，受到了廣泛的關注及應用。UPLC-MS/MS 具有痕量的檢測靈敏度、準確的定量分析能力，成為植物毒素檢測研究和標準制定的重要參考方法。具有強大定性能力和全譜完整信息的UPLC-HRMS 大受青睞。靜電軌道阱質譜憑借其精確質量的一級、二級質譜建立的蜂蜜中植物源毒性物質數據庫，當蜂蜜中毒事件發生時能實現無標準品非靶向高通量篩查，已成為未知毒物定性檢測的利器。上述新方法、新技術的應用亟待建立快速高效、易于操作并且適用范圍較廣的檢測方法，從而提高蜂蜜中植物源毒性分的監管力度，為蜂蜜的安全管理提供技術支持。