基于熒光SSR構建中國糜子核心種質DNA分子身份證

薛亞鵬，丁藝冰，王宇卓，王曉丹，曹曉寧，Santra Dipak K，陳凌，喬治軍，王瑞云,

基于熒光SSR構建中國糜子核心種質DNA分子身份證

薛亞鵬1，丁藝冰1，王宇卓1，王曉丹1，曹曉寧2，Santra Dipak K3，陳凌2，喬治軍2，王瑞云1,2

1山西農業大學農學院，中國山西太谷 030801；2山西農業大學農業基因資源研究中心/農業農村部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，中國山西太原 030031；3內布拉斯加大學林肯分校農藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國內布拉斯加州斯克茨布拉夫 69361

【目的】糜子（L.）作為一種古老的粟類作物，種質豐富，基于熒光SSR標記構建其DNA分子身份證可為資源的數字化管理提供理論依據和分子檢測工具。【方法】以235份中國糜子核心種質為試驗材料，對山西農業大學農學院糜子作物分子育種課題組前期開發的糜子特異性SSR標記進行多次PCR篩選和優化后獲取核心引物。基于糜子參考基因組信息，經過BLAST序列比對后將核心標記進行染色體定位。在SSR引物的5′端標注熒光（FAM/HEX），利用毛細管電泳給出材料的基因型，采用“0，1”二進制編碼方式記錄擴增條帶的有無，使用ID Analysis 4.0檢測材料的區分程度。采用十進制（0—9）統計擴增片段大小以獲得材料的字符串分子身份證。使用Popgene、Powermarker、MEGA、NTSYS進行遺傳多樣性、遺傳聚類和主成分分析。利用二維碼在線軟件（https://cli.im/）給出材料的二維碼DNA分子身份證。【結果】PCR擴增結果發現，7個熒光SSR（RYW3、RYW6、RYW11、RYW18、RYW37、RYW43和RYW125）組合在一起可以將235份材料全部區分開。BLAST結果表明，RYW18、RYW37分布在第2染色體，分別位于0.60和0.80 cM處；RYW125位于第4染色體，定位在10.40 cM處；RYW43、RYW6分布在第5染色體，分別位于52.80和53.00 cM處；RYW11和RYW3定位在第6染色體，分別位于2.10和20.70 cM處。遺傳多樣性分析結果表明，235份材料在7個位點共檢出87個等位變異，每個位點檢出3（RYW11）—25（RYW6）個，平均為12.4286；檢出Shannon多樣性指數（）變幅為0.2055（RYW18）—2.0587（RYW6），平均1.1398；觀測雜合度（o）為0.0086（RYW11）—0.9455（RYW18）；期望觀測雜合度（e）為0.0795（RYW18）—0.7452（RYW6）；Nei’s基因多樣性指數（）為0.0793（RYW18）—0.7452（RYW6）；多態性信息含量（）為0.0334（RYW11）—0.8071（RYW6），平均為0.5185。聚類分析和主成分分析均將材料劃歸8個類群。將電泳條帶進行數字編碼，利用7個標記組合，構建了全部材料的字符串和二維碼DNA分子身份證。【結論】以235份中國糜子核心種質為試驗材料，利用PCR擴增和毛細管電泳篩選到7個糜子熒光SSR核心標記。基于糜子參考基因組信息將上述標記定位在4條染色體上。利用上述標記擴增供試材料，給出遺傳多樣性衡量參數，基于遺傳距離將材料聚為8個類群，主成分分析解決了聚類結果中出現的偏差。依照最少引物區分最多種質的原則，利用十進制編碼方式給出材料的字符串DNA分子身份證，結合表型數據，利用二維碼在線軟件構建了全部材料的二維碼DNA分子身份證。

糜子；毛細管電泳；熒光SSR；DNA分子身份證

0 引言

【研究意義】糜子（L.）屬于禾本科黍屬，一年生喜溫耐旱作物[1]。作為起源于中國的一種古老粟類作物[2]，糜子在世界六大洲（亞洲、歐洲、非洲、南美洲、北美洲和大洋洲）均有分布，其中，中國、俄羅斯等國家種植面積較大[3-4]。在中國，北至內蒙古自治區呼倫貝爾市海拉爾市，南至海南省瓊海市，西至新疆維吾爾自治區阿圖什市，東至黑龍江省同江市，均有糜子分布，可劃分為7個生態栽培區（東北春糜子區、華北夏糜子區、北方春糜子區、黃土高原春夏糜子區、西北春夏糜子區、青藏高原春糜子區、南方秋冬糜子區）[5-6]。在年均降水較低的干旱和半干旱地區，糜子是當地居民主糧；由于糜子具抗貧瘠特性，也是邊遠山區的開荒作物之一[7-8]，適宜種植在中下等和邊際農田。目前，世界上保存的糜子種質資源有20 000余份，國內占比近半[9]。因此，面對如此眾多的資源，如何對其進行高效管理以便有效利用成為亟待解決的問題。【前人研究進展】由于受所處地理區域和溫度等因素影響，異源四倍體糜子種質DNA信息繁雜[10]，通過其差異可以進行資源辨別。基于SSR標記對國內外糜子種質資源的研究較多。薛延桃等[11]利用103個標記分析146份材料，發現國內野生資源的遺傳差異高于國外，且中國河北省可能為糜子發源地。石甜甜等[12]利用144個標記檢測96份材料，基于UPGMA聚類和主成分分析分別材料劃歸3個和6個類群。連帥等[13]利用63個標記評估192份資源，結果表明，中國是糜子起源中心。DNA條形碼自2003年由加拿大學者提出，以DNA片段作為條形碼快速準確識別和鑒定物種，多為針對DNA序列采用分子標記進行種內鑒定。DNA分子身份證是將種質資源的DNA片段轉化為特有的字符串、條形碼或二維碼等，并加入其他的品質等相關信息，達到對材料的數字化管理[14-16]。李清等[17]用30個SSR分析96份大豆（）種質資源，發現僅用其中的6個標記即可構建全部材料的DNA分子身份證。樊曉靜等[18]基于24個SNP標記分析103份國內外茶樹（）資源，首先構建了指紋圖譜，結合種質來源、品質等信息構建了所有材料的DNA分子身份證。張梟等[19]用14個SSR擴增48份山楂（）資源，將材料劃分為2類，并構建了各材料的DNA分子身份證。與傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，熒光毛細管電泳檢測更為精確，且重復性好、分析通量大[20]，熒光SSR標記得到廣泛應用。王瑞云等[21]利用15個熒光SSR對中國11個省/區的132份糜子材料進行了遺傳多樣性分析，將材料劃歸4個群組。冉昆等[22]開發了40個SSR，檢測45份山東地區的梨（L.）種質資源，發現僅用其中的10個標記加注熒光后即可構建全部材料的DNA分子身份證。郭艷春等[23]用46個核心SSR分析64份黃麻（）應用核心種質，發現僅用其中的12個標記加注熒光后即可將全部材料區分，同時構建了材料的DNA分子身份證。鄭永勝等[24]利用2 438個SSR擴增8個小麥材料，篩選出260個多態性標記，加注熒光后擴增48份小麥育成品種，發現42個熒光標記可用于鑒定小麥品種。【本研究切入點】糜子作為中華民族農耕文明的載體作物，由于產量低下，與世界五大糧食作物水稻、小麥、玉米、大麥、高粱相比，基礎研究薄弱，SSR標記缺乏，影響DNA分子身份證的構建。【擬解決的關鍵問題】本研究擬以糜子微核心種質為材料，利用熒光SSR標記構建材料的DNA分子身份證，為糜子種質資源的快速準確鑒定提供分子檢測工具。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用材料為糜子（L.）的核心種質，共計235份[25]，由中國農業科學院作物科學研究所提供（電子附表1）。

1.2 DNA提取

剪取糜子三葉期葉片，采用CTAB改良法[26]提取基因組DNA，DNA完整性、純度和濃度檢測方法同文獻[27]。

1.3 引物篩選

利用14份地理來源（分別來自中國的山西、黑龍江、廣東、新疆、甘肅、內蒙古、河北、西藏、遼寧、山東、吉林、陜西和寧夏，以及印度）存在差異的糜子材料（表1）篩選山西農業大學糜子作物分子育種課題組前期開發的169個SSR[27-28]，在條帶清晰、多態性好的標記引物5′端標注熒光基團。PCR擴增體系及反應程序同薛亞鵬等[29]，熒光引物合成、PCR擴增產物檢測、毛細管電泳結果分析均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 DNA分子身份證的構建

將毛細管電泳獲得的DNA分子量，進行數字（根據片段位置區分，同一位置有條帶記為1，無條帶記為0）+數字化處理。用資源特征分析軟件ID Analysis 4.0檢測材料是否完全區分；用PowerMarker3.25、PopGene 1.32、MEGA 5.0和NTSYS 2.11進行遺傳多樣性參數的計算、UPGMA聚類和主成分分析[30-32]；將引物擴增獲得的帶型按分子量從小到大依次排列，用數字進行編碼，由此組成字符串DNA分子身份證。利用二維碼在線技術（https://cli.im/）將材料的基本信息（包括名稱、統一編號、來源地、字符串）轉化為可掃描的二維碼DNA分子身份證。

2 結果

2.1 引物篩選

利用169個SSR擴增14份糜子材料（表1），用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物，篩選到40個多態性好的標記，用其擴增32份微核心種質（未列出），發現15個標記條帶清晰（表2），在其引物5′端添加熒光基團FAM/blue或HEX/green。

表2 15對熒光SSR引物信息

2.2 基于核心引物的235份材料的遺傳多樣性參數

利用15對熒光SSR引物擴增235份材料，發現7對引物（RYW3、RYW6、RYW11、RYW18、RYW37、RYW43和RYW125）組合在一起可以將全部材料區分開；經過blast比對，確定了7個標記在糜子染色體上的位置（圖1）。RYW18、RYW37分布在第2染色體，分別位于0.60和0.80 cM處；RYW125位于第4染色體，定位在10.40 cM處；RYW43、RYW6分布在第5染色體，分別位于52.80和53.00 cM處；RYW11和RYW3定位在第6染色體，分別位于2.10和20.70 cM處。

利用7對熒光SSR引物擴增235份材料，部分材料毛細管電泳檢測條帶圖見圖2（RYW43），標記的熒光有2種，除RYW43為綠色外，其他6個均為藍色。從7對引物的多態性信息位點及條帶編碼（表3）可以看出，7對引物共擴增出125個多態性條帶，平均每對引物擴增17.85個。

用7對引物擴增235份材料，從表4可以看出，235份材料在7個位點共檢出87個等位變異，平均每個位點為12.4286個，變幅為3.0000（RYW11）—25.0000（RYW6）；檢出的Shannon多樣性指數（）為0.2055（RYW18）—2.0587（RYW6），平均為1.1398；觀測雜合度（o）為0.0086（RYW11）—0.9455（RYW18），平均為0.5158；期望觀測雜合度（e）為0.0795（RYW18）—0.7469（RYW6），平均為0.5176；Nei’s基因多樣性指數（）為0.0793（RYW18）—0.7452（RYW6），平均為0.5163；多態性信息含量（）為0.0334（RYW11）—0.8071（RYW6），平均為0.5185。

利用7對核心引物對235份糜子種質進行區分（表5）。7個引物的區分率為0.00%（RYW18）—7.23%（RYW6）；其中RYW43和RYW125均可區分16份（6.81%），RYW3可區分10份（4.26%），RYW11和RYW37均可區分較少材料（2份，0.85%）。6個引物組合的區分率為19.57%（RYW3+RYW6）—100%（RYW3+RYW6+RYW11+RYW18+RYW37+RYW43+RYW125）；其中，2引物和3引物組合僅能區分約1/5（19.57%、20.42%）的材料，4引物組合可區分約1/4（26.38%）的材料，5引物組合僅可區分37.45%的材料，而6引物組合則可區分材料近70%（68.51%），最終用7引物組合將全部材料分開。

2.3 235份糜子種質資源的聚類分析

基于UPGMA對235份糜子材料進行聚類（圖3）。可以看出，235份材料劃歸8個類群。每個類群包括材料數目不同，其中，類群Ⅲ最多，有80份，來自除青藏高原春糜子區的其余6個生態區和其他國家；其次為類群Ⅱ，有56份，來自糜子7個生態區和其他國家；第三為類群Ⅷ，有46份，來自除青藏高原春糜子區的其余6個生態區和其他國家；第四為類群Ⅳ和Ⅵ均有16份；類群Ⅴ和Ⅰ較少，分別有11和10份；類群Ⅶ最少，僅有1份。黃土高原春夏糜子區的材料在6個類群（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ）中均有分布，分別為20、20、2、6、2和5份。

表3 7對核心引物毛細管電泳結果及帶型編碼

圖2 RYW43擴增部分材料的毛細管多態性電泳圖

表4 7對熒光SSR的遺傳多樣性參數

材料編號同附表1 The accession number is the same as the Supplemental Table 1

圖4 基于SSR的235份糜子資源的主成分分析圖

2.4 235份糜子種質資源的主成分分析

根據基因分型對235份糜子資源進行主成分分析（圖4）。可以看出，前3個主成分分別解釋了基因總變異的79.05%（PC1）、6.26%（PC2）和3.87%（PC3）。將糜子參試材料分為8類，與材料的來源地基本一致。

2.5 235份糜子種質資源DNA分子身份證的構建

對毛細管電泳結果進行“數字”編碼，將每個引物的特征編碼結合形成特定的字符串（電子附表2）。如白糜子（00000101）的字符串為12150301040418，表示用引物RYW3、RYW6、RYW11、RYW18、RYW37、RYW43、RYW125擴增材料后，對應的片段分別為149/169/198（12）、195/242（15）、213/223（03）、376（01）、196/203/209（04）、181（04）和202/227（18）；黃糜子（00000333）的字符串10180301030018，表示用引物RYW3、RYW6、RYW11、RYW18、RYW37、RYW43和RYW125擴增材料后，分別對應片段149/156（10）、195/242/373（18）、213/223（03）、376（01）、196/203（03）、0（00）和202/227（18）；依此類推。在上述字符串基礎上，加入材料的其他信息（統一編號、名稱和來源等），一并導入二維碼在線生成器，獲得材料的二維碼DNA分子身份證，材料1—12的二維碼DNA分子身份證見圖5，其他材料的圖例見附圖1。

圖5 材料1—12的二維碼DNA分子身份證

3 討論

3.1 糜子特異性SSR標記的染色體定位

SSR標記是種質資源遺傳差異的重要分子檢測工具，在小麥、大豆等作物中廣泛運用[15-17, 24]。截至2017年，王瑞云研究發現糜子中開發的SSR僅有2 631個，其中，糜子特異性標記為2 326個，其他為種間標記[8]。近年來，基于RNA-Seq高通量測序手段構建了215個SSR標記，但是均沒有定位在染色體上[10, 21, 28, 33]。2019年，隨著糜子基因組測序結果的公布，本研究通過blast比對，將7個SSR標記定位在糜子的4條染色體（Chr.2、Chr.4、Chr.5和Chr.6）上。其中一個SSR為低基元（RYW125），位于Chr.4的10.40 cM處。其他6個均為高基元，RYW18和RYW37分別分布在Chr.2的0.60和0.80 cM處；RYW43和RYW6分別分布在Chr.5的52.80和53.00 cM處；RYW11和RYW3分布在Chr.6的2.10和20.70 cM處。2023年，以育成品種晉黍7號為材料，構建了全基因組精細序列圖譜，探明異源四倍體糜子處于二倍化的早期階段，亞基因組優勢正在建立，突變可能更多地發生在標記為較低表達水平的基因上[34]。目前，鑒定糜子粳糯性的Indel功能標記（RYW214）已經開發[35]，一批SSR標記將被錨定在染色體上，有益于糜子育種中親本材料的選配。

3.2 聚丙烯酰胺凝膠和毛細管電泳的DNA擴增片段多態性檢測差異

人類要全面發展，健康首當其沖，《“健康中國2030”規劃綱要》引導人們合理膳食，不僅需要主糧（如小麥）支撐，雜糧（糜子）更是不可或缺[36]。郝晨陽等[37]以小麥為材料，比較了SSR聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光SSR毛細管電泳檢測手段的差異，發現后者的效率是前者的7—8倍。糜子方面，陳小紅等[38]以130份糜子為試驗材料，用SSR銀染檢測，發現用17個SSR可以區分全部材料，本研究以235份糜子核心種質為材料，發現僅用7個熒光SSR即可區分全部材料，材料多于前者，標記少于前者，靈敏度明顯高于前者。林元香[39]則以272份山西糜子資源為材料，比較了SSR和熒光SSR的檢測結果，發現后者是前者的7倍。

3.3 基于土特產的多元化黃米食品

中國素有“飲食王國”之美譽，糜子食品數不勝數。糜子脫殼后稱黃米，磨粉后可制作各種面食。基于一方水土，開發糜子鄉土資源。糜子是中華民族農耕文明的載體作物，曾在長城內外、黃河兩岸眾多區域均有分布。突出地域特點，體現當地風情。炒米曾是陜甘寧邊區和內蒙古自治區游牧民族在馬背上營生的主食，油糕是許多地方婚喪嫁娶中必不可少的一道食品。2022年4月，中國農業大學出版社出版了沈群主編的《雜糧與科學的美味邂逅》。山西省有許多黃米食品，包括平定縣的油糕和稷米面煎餅、盂縣的棗介糕、陽高縣的素糕、長治市壺關縣的小車刀切糕、臨汾市的黃米蒸飯、忻州市定襄縣的黃米粽子、嵐縣的糜子粉和河曲縣的糜米酸粥等。陜西的黃米食品有延安市黃陵縣的黃黃饃，又叫黃黃，原料為硬糜子。河北地區的薛家窩頭，又叫黃金塔，是光緒年間的朝廷貢品，緣于薛木延在李賈村過廟趕集售賣時被李連英發現，慈禧太后品嘗后大加贊賞。北京和天津一帶的黃米食品有驢打滾，又叫豆面糕/豆面卷子，始于清朝，是沾滿豆面的年糕。東北地區的黃米食品有黏豆包，冬季餐桌不可或缺，貯藏于戶外缸中；朝鮮族的黃米打糕/引絕餅，又叫黃打糕[36]。

真正建成糜子產業，形成集群。2012年，陜西省府谷縣被中國糧食行業協會命名為“中國黃米之鄉”，建有高標準糜子種植基地，百畝樣板田曾創造畝（667 m2）產410 kg的全國紀錄，深加工企業將黃米產品推銷至世界各地。2018年，100名志愿者在“品味府谷”美食文化節上拼接4.5萬片黃米糕創下“最長油炸糕點”吉尼斯世界紀錄。2021年，府谷黃米入選全國名特優新農產品名錄。2023年，陜西省府谷縣糜子（黃米）產業協會創作了《黃米歌謠》。眾多的糜子食品來源于數以萬計的糜子種質資源，要想做出具有地方特色和口感正宗的黃米食品，必須探明資源本底，搞清其遺傳差異，構建資源的二維碼DNA分子身份證可以有效鑒別資源。陳小紅等[38]構建糜子的分子身份證僅采用二進制的“0，1”，本研究所構建的分子身份證還采用了十進制（0—9）。為了搞清全世界2萬余份糜子資源的遺傳背景，構建其DNA分子身份證，山西農業大學糜子作物分子育種課題組正在研發三十二進制和六十四進制以及更高進制的編碼方法，助力世界人民糧食安全和膳食營養平衡。

另外，主成分分析可以解決UPGMA聚類結果中出現的偏差。何杰麗等[28]基于EST-SSR評估國內外不同生態區的144份糜子資源，UPGMA聚類結果表明，黃土高原春夏糜子區的材料（50號（紫桿白黍）和107號（野糜））分布在不同類群中，分別劃歸類群C12和C2，而主成分分析則將2份材料均劃歸在黃土高原春夏糜子區。本研究也有類似現象發生，聚類結果表明，東北春糜子區的材料（59號（金縣黃糜子）和235號（2048）、5號（大白黍）和6號（螞蚱眼））分布在不同類群中，前兩者劃歸類群Ⅲ，后兩者劃歸類群Ⅷ，而主成分分析則將全部材料均劃歸為一類。

4 結論

基于糜子參考基因組信息，在4條染色體（Chr.2、Chr.4—Chr.6）上定位了7個特異性SSR標記。基于十進制編碼方式，采用熒光SSR標記毛細管電泳檢測手段構建了235份中國糜子核心種質的二維碼DNA分子身份證，構建的分子身份證互不相同，可以將材料完全區分開。

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附表1 參試糜子材料的品種及來源

supplement table 1 The varieties and sources of the broomcorn millet material to be tested

統一編號Code序號Number名稱Name來源Source 000001011白糜子Baimeizi中國黑龍江Heilongjiang, China 000002812Jan-55黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 000003333黃糜子Huangmeizi中國吉林Jilin, China 000004374大紅黍Dahongshu中國遼寧Liaoning, China 000004405大白黍Dabaishu中國遼寧Liaoning, China 000004546螞蚱眼Mazhayan中國遼寧Liaoning, China 000004787黃旗糜子Huangqimeizi中國內蒙古Inner Mongolia, China 000005258巴林左疙瘩黍Balinzuogedashu中國內蒙古Inner Mongolia, China 000006509準旗醬黃黍Zhunqijianghuangshu中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000068410伊盟良56-2黍Yimengliang56-2shu巴盟農業科學研究所Bameng agricultural science institute 0000075611小黍子Xiaoshuzi中國河北Hebei, China 0000105512雞冠黍Jiguanshu中國山西Shanxi, China 0000145313軟糜子Ruanmeizi中國山西Shanxi, China 0000152814黑軟黍Heimeizi中國山西Shanxi, China 0000155915紅軟黍Huangruanshu中國山西Shanxi, China 0000161116一點黃Yidanhuang中國陜西Shaanxi, China 0000183917掃帚軟糜Saozhouruanmei中國陜西Shaanxi, China 0000216018和林紅糜子Helinhongmeizi中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000247319伊選大紅糜Yixuandahongmei伊盟農業科學研究所Yimeng agricultural science institute 0000268420張掖老黃糜子Zhangyelaohuangmeizi中國甘肅Gansu, China 0000304121廣河黃糜Guanghehuangmei中國甘肅Gansu, China 0000305622黃糜子Huangmeizi中國新疆Xinjiang, China 0000314423本地糜子Bendimeizi中國山西Shanxi, China 0000317724花糜 Huamei中國山西Shanxi, China 0000323725小黃黍Xiaohuangmei中國山西Shanxi, China 0000328926紫桿黍Ziganshu中國山西Shanxi, China 0000340527白糜子Baimeizi中國山西Shanxi, China 0000364028小紅糜Xiaohongmei中國陜西Shaanxi, China 0000419829金守黍Jinshoushu中國廣東Guangdong, China 0000423030西北天糜子（黍）Xibeitianmeizi (shu）中國吉林Jilin, China 0000441131螞蚱眼Mazhayan中國山東Shandong, China 0000557432黃糜子Huangmeizi中國青海Qinghai, China 0000570033翰章黃糜Hanzhanghuangmei中國吉林Jilin, China 0000570834千溝黃糜子Qiangouhuangmeizi中國吉林Jilin, China 00005884358311/4/5伊盟農業科學研究所Yimeng agricultural science institute 0000612736黍子Shuzi中國河北Hebei, China 0000643837烏克蘭黍Wukelanshu中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000679838寧夏黃糜Ningxiahuangmei寧夏農業科學院Ningxia academy of agricultural sciences 0000707139黍米（糜）Shumid（mei）中國河北Hebei, China 0000729740賀蘭大紅Helandahong中國寧夏Ningxia, China 0000733241鼓鼓頭糜Gugutoumei中國甘肅Gansu, China 0000750242黃皮糜Huangpimei中國青海Qinghai, China 0000762943吉林黍Jilinshu中國吉林Jilin, China 0000766744外引黍4號Waiyinshu 4 hao美國USA 0000767745A85-6中國山西Shanxi, China 0000783246嫩黍23Neishu23中國黑龍江Heilongjiang, China 0000008247黃糜子Huangmeizi中國黑龍江Heilongjiang, China 0000010248黑鵝頭Heietou中國黑龍江Heilongjiang, China 0000012149紅鵪鶉尾Hong anchunwei中國黑龍江Heilongjiang, China 0000013250鵪鶉尾Anchunwei中國黑龍江Heilongjiang, China 0000014751麥糜子Maimeizi中國黑龍江Heilongjiang, China 0000014952小麥糜子Xiaomaimeizi中國黑龍江Heilongjiang, China 0000018353黑糜子Heimeizi中國黑龍江Heilongjiang, China 00000277545-Feb黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 0000033055黎糜子Limeizi中國吉林Jilin, China 0000038856黑糜子Heimeizi中國吉林Jilin, China 0000040557黑糜子Heimeizi中國吉林Jilin, China 0000043658黃糜子Huangmeizi中國遼寧Liaoning, China 0000047559金縣黃糜子Jinxianhuangmeizi中國遼寧Liaoning, China 0000048260呼盟黑粘糜Humengheinianmei中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000056961五原黑黍子Wuyuanheishuzi中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000058262臨河雙粒黍Linheshuanglishu中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000060763杭后小青黍Hanghouxiaoqingshu中國內蒙古Inner Mongolia, China 0000060964巴盟黃黍子Bamenghuangmeizi巴盟農業科學研究所Bameng agricultural science institute 0000070265惠農黃粘黍Huinonghuangnianshu中國寧夏Ningxia, China 0000071066皋蘭鴨蛋青Gaolanyadanqing中國甘肅Gansu, China 0000074267靈合紅粘糜Linghehongnianmei中國甘肅Gansu, China 0000074768清水粘糜子Qingshuinianmeizi中國甘肅Gansu, China 0000075069白糜子baimeizi中國新疆Xinjiang, China 0000080470骨都白Gudubai中國河北Hebei, China 0000081571黑糜子Heimeizi中國河北Hebei, China 0000082272粘黍子Nianmeizi中國河北Hebei, China 0000082573高粱黍Gaoliangshu中國河北Hebei, China 0000082974小白黍Xiaobaishu中國山西Shanxi, China 0000084075六十天小紅黍Liushitianxiaohongshu中國山西Shanxi, China 0000084576老來紅Laolaihong中國山西Shanxi, China 0000093677跳蚤黍Tiaozaoshu中國山西Shanxi, China 0000095778污咀黍Wuzuishu中國山西Shanxi, China 0000099179小白黍Xiaobaishu中國山西Shanxi, China 0000099880大瓦灰Dawahui中國山西Shanxi, China 0000105681灶黑白Zaoheibai中國山西Shanxi, China 0000112182黃羅黍Huangluoshu中國山西Shanxi, China 0000118283小白粘糜子Xiaobainianmeizi中國山西Shanxi, China 0000125184小黑黍Xiaoheishu中國山西Shanxi, China 0000128385條帚軟糜Tiaozhouruanshu中國山西Shanxi, China 0000131286白粘黍Bainianshu中國山西Shanxi, China 0000133187狗尾蛋Gouweidan中國山西Shanxi, China 0000146788白黍Baishu中國山西Shanxi, China 0000147889軟黍Ruanshu中國山西Shanxi, China 0000150090黑灰軟黍Heihuiruanshu中國山西Shanxi, China 0000153091紅糜子Hongmeizi中國山西Shanxi, China 0000154792白黍Baishu中國山西Shanxi, China 0000155393黑黍Heishu中國山西Shanxi, China 0000158194白軟黍Bairuanshu中國山西Shanxi, China 0000159995灰軟糜Huiruanshu中國陜西Shaanxi, China 0000160196紫稈紅黍Ziganhongshu中國陜西Shaanxi, China 0000166597大紅糜Dahongmei中國陜西Shaanxi, China 0000176898白軟糜Bairuanmei中國陜西Shaanxi, China 0000178599黑軟糜Heiruanmei中國陜西Shaanxi, China 00001812100小紅軟糜Xiaohongruanmei中國陜西Shaanxi, China 00001818101黃軟糜Huangruanmei中國陜西Shaanxi, China 00001897102紅糜Hongmei中國陜西Shaanxi, China 00001951103黃黍子Huangshuzi中國陜西Shaanxi, China 00001987104熟谷Shugu中國黑龍江Heilongjiang, China 0000202310515黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 000020321066黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 00002062107開魯板黃糜Kailubanhuangmei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002142108農烏4號青糜Nongwu 4 qingmei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002155109豐鎮大白糜Fengzhendabaimei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002231110五原小黃糜Wuyuanxiaohuangmei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002368111達旗大黃糜子Daqidahuangmeizi中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002385112達旗青糜子Daqiqingmeizi中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002416113準旗紫稈紅糜Zhunqiziganhongmei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00002502114伊盟75066-5-2糜Yimeng 75066-5-2mei伊盟農業科學研究所Yimeng agricultural science institute 00002530115賀蘭二黃Helanerhuang中國寧夏Ningxia, China 00002583116密穗紅misuihong中國寧夏Ningxia, China 00002614117小黃糜子Dahuangmeizi中國寧夏Ningxia, China 00002628118大紅糜子Dahongmeizi固原農業科學研究所Guyuan agricultural research institute 00002641119西吉小黃糜Xijixiaohuangmei中國寧夏Ningxia, China 00002651120寧糜6號Ningmei 6寧夏農業科學院Ningxia academy of agricultural sciences 00002687121民樂紅糜子Minlehongmeizi中國甘肅Gansu, China 00002712122景泰疙瘩紅Jingtaigedahong中國甘肅Gansu, China 00002741123永登小黑糜Yongdengxiaoheimei中國甘肅Gansu, China 00002800124靖遠紫稈Jingyuanzigan中國甘肅Gansu, China 00002901125華池黃草紅糜Huachihuangcaohongmi中國甘肅Gansu, China 00002930126寧縣竹葉青黃硬糜Ningxianzhuyeqinghuangyingmei中國甘肅Gansu, China 00002932127寧縣大黃粘糜子Ningxiandahuangnianmeizi中國甘肅Gansu, China 00003039128東鄉朵麻糜Dongxiangduomamei中國甘肅Gansu, China 00003111129紅糜Hongmei中國新疆Xinjiang, China 00003117130黃糜Huangmei中國新疆Xinjiang, China 00003127131糜Mei中國新疆Xinjiang, China 00003167132小青糜Xiaoqingmei中國山西Shanxi, China 00003368133黍子Shuzi中國山西Shanxi, China 00003376134黃硬黍Huangyingshu中國山西Shanxi, China 00003559135黃硬黍Huangyingshu中國山西Shanxi, China 00003561136當地糜Dangdimei中國山西Shanxi, China 00003586137黑糜子Heimeizi中國陜西Shaanxi, China 00003656138二黃糜Erhuangmei中國陜西Shaanxi, China 00003678139小紅糜Xiaohongmei中國陜西Shaanxi, China 00004200140黃稷子Huangjizi中國安徽Anhui, China 00004203141白稷子Baijizi中國江蘇Jiangsu, China 00004228142黑糜子黍Heimeizishu中國吉林Jilin, China 00004267143小白黍Xiaobaishu中國內蒙古Inner Mongolia, China 00004268144小紅黍Xiaohongshu中國內蒙古Inner Mongolia, China 00004314145正寧紅粘糜（黍）Zhengninghongnianmei（shu）中國甘肅Gansu, China 00004368146白粒黍Bailishu中國山東Shandong, China 00004415147白黍子Baishuzi中國山東Shandong, China 00004580148黍子Shuzi中國山東Shandong, China 00004677149紅軟糜（黍）Hongruanmei（shu）中國陜西Shaanxi, China 00004704150白殼糜（黍）Baikemei（shu）中國陜西Shaanxi, China 00004800151紅糜（黍）Hongmei（shu）中國陜西Shaanxi, China 00004863152034-2黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 00004866153紅糜子Hongmeizi中國內蒙古Inner Mongolia, China 00004881154狼山462Langshan 462巴盟農業科學研究所Bameng agricultural science institute 00004985155慶陽餓死牛Qingyangesiniu中國甘肅Gansu, China 00005008156張川麻糜子Zhangchuanmameizi中國甘肅Gansu, China 00005169157黑稷子Heijizi中國山東Shandong, China 00005191158塞蓋德斯Saigaidesi中國山東Shandong, China 00005241159灰糜子Huimeizi中國陜西Shaanxi, China 00005245160紅硬糜Hongyingmei中國陜西Shaanxi, China 00005452161夯糜子Hangmeizi中國陜西Shaanxi, China 00005472162梟頭糜Xiaotoumei中國陜西Shaanxi, China 00005532163大黃糜Dahuangmei中國青海Qinghai, China 00005583164黑子Heizi中國青海Qinghai, China 000058391658403/7/2伊盟農業科學研究所 Yimeng agricultural science institute 00006036166小紅黍Xiaohongshu中國河北Hebei, China 00006159167螞蚱眼Mazhayan中國河北Hebei, China 00006175168大黃黍Dahuangshu中國河北Hebei, China 00006200169大紫稈Dazigan中國河北Hebei, China 00006234170河間白黍子Hejianbaishuzi中國河北Hebei, China 00006248171小紅黍Xiaohongshu中國河北Hebei, China 00006253172黍子Shuzi中國河北Hebei, China 00006257173青龍黃黍子Qinglonghuangshuzi中國河北Hebei, China 00006310174紫秸白Zijiebai中國河北Hebei, China 000064831752096黑龍江農業科學院 Heilongjiang academy of agricultural sciences 000064841762275黑龍江農業科學院 Heilongjiang academy of agricultural sciences 000064931772228黑龍江農業科學院Heilongjiang academy of agricultural sciences 00006523178黃黍Huangshu中國內蒙古Inner Mongolia, China 00006528179內黍一點紅Neishuyidianhong中國內蒙古Inner Mongolia, China 00006557180榆3-39 Yu3-39山西品種資源研究所 Shanxi institute of variety resources 00006570181眼皮薄Yanpibao中國吉林Jilin, China 00006575182黃糜（黍）Huangmei（shu）中國山東Shandong, China 00006580183黍子Shuzi中國山東Shandong, China 00006632184黃黍子Huangshuzi濰坊農業科學研究所 Weifang institute of agriculture and science 00006655185糯黍Nuoshu中國海南Hainan, China 00006681186札達糜Zhadamei中國西藏Xizang, China 00006682187古浪半個紅Gulangbangehong中國甘肅Gansu, China 00006764188典型紫稈野糜Dianxingziganyemei中國內蒙古Inner Mongolia, China 00006766189野糜子Yemeizi中國新疆Xinjiang, China 00006776190海原紫稈紅Haiyuanziganhong固原農業科學研究所 Guyuan agricultural research institute 00006811191羊眼睛青糜子Yangyanjingqingmeizi固原農業科學研究所 Guyuan agricultural research institute 00006842192豐雙-4Shuangfeng-4固原農業科學研究所 Guyuan agricultural research institute 00006854193紅花糜子Honghuameizi固原農業科學研究所 Guyuan agricultural research institute 00007131194白黍子Baishuzi中國河北Hebei, China 00007220195白黍子Baishuzi中國河北Hebei, China 00007258196黃糜Huangmei中國遼寧Liaoning, China 00007265197太原3164Taiyuan3164山西品種資源研究所 Shanxi institute of variety resources 00007269198太原3048Taiyuan3048山西品種資源研究所 Shanxi institute of variety resources 00007291199平羅二黃Pingluoerhuang中國寧夏Ningxia, China 00007344200吐魯番Turpanmi中國新疆Xinjiang, China 00007361201雁北天糜Yanbeitianmei中國山西Shanxi, China 0000736620278前蘇聯Former Russia 00007367203支多奧斯支Chidoosch前蘇聯Former Russia 00007369204色查爾托Sacherto波蘭Poland 00007371205灰糜Huimei波蘭Poland 00007391206790051印度India 00007417207臘黃糜Lahuangmei中國青海Qinghai, China 00007430208土黃糜Tuhuangmei中國青海Qinghai, China 00007455209牛尾黃Niuweihuang中國青海Qinghai, China 00007468210灰糜子Huimeizi中國青海Qinghai, China 00007478211白圪塔糜Baigedamei中國青海Qinghai, China 00007479212黃粒糜Huanglimei中國青海Qinghai, China 00007518213A75-2中國遼寧Liaoning, China 00007564214B75-8中國陜西Shaanxi, China 00007664215外引黍1號Waiyinshu1美國USA 00007681216A85-10中國山西Shanxi, China 00007700217A85-29中國農業科學院Chinese Academy of Agricultural Sciences 00007716218A85-45中國山東Shandong, China 00007740219B85-10中國陜西Shaanxi, China 00007750220B85-20中國陜西Shaanxi, China 00007755221B85-25中國陜西Shaanxi, China 00007798222B85-68中國陜西Shaanxi, China 00007844223A75-45中國甘肅Gansu, China 00007869224A75-70中國山西Shanxi, China 00007889225E75-30中國甘肅Gansu, China 00007917226A85-70中國甘肅Gansu, China 00007922227A85-75中國甘肅Gansu, China 00007927228A85-80中國陜西Shaanxi, China 00007935229A85-88中國寧夏Ningxia, China 00007948230A85-101中國陜西Shaanxi, China 00007963231B85-62中國陜西Shaanxi, China 00007973232B85-72中國陜西Shaanxi, China 00007991233B85-90中國陜西Shaanxi, China 00008016234紫稈糜Ziganmei中國山西Shanxi, China 000064572352048嫩江農業科學研究所 Nenjiang institute of agriculture and science

附表2 參試糜子材料的字符串

supplement table 2 Character string of the broomcornmillet material to be tested

序號Number統一編號Code字符串Character string序號Number統一編號Code字符串Character string 10000010112150301040418410000733215180301040018 20000028119180303041518420000750207180301041518 30000033310180301030018430000762913150301040018 40000043701150301040102440000766701180302040418 50000044007160301040002450000767706180302050002 60000045401180301041502460000783216180301040018 70000047808180301040002470000008202050300010002 80000052501220301050102480000010202050301011502 90000065001150301050418490000012102050300010102 100000068401180301051518500000013202300305010002 110000075601140301041118510000014718330301010002 120000105501180301050418520000014902340301060102 130000145301180301050002530000018302060301010102 140000152807180301040102540000027702250301030002 150000155907180301041518550000033002060300010002 160000161104180301060002560000038802060301011502 170000183910180301051018570000040502320300061502 180000216003180301050118580000043602310301030417 190000247301180301040318590000047502050301060017 200000268401200302050118600000048202300300060002 210000304107180301041518610000056902040300060102 220000305601150301040118620000058202290303061502 230000314409000301040018630000060702300301060102 240000317701150301041518640000060902040301060602 250000323708130301050118650000070202040301010002 260000328911120301050018660000071002050301010002 270000340514110301050018670000074202020301010002 280000364007180301050018680000074702230301010100 290000419815140301050018690000075002060301060100 300000423001170301040018700000080402070301012818 310000441101180301040118710000081502370301010002 320000557410180301040018720000082202100300030017 330000570001180301050118730000082518100301030018 340000570814180301040118740000082902250301011102 350000588401180301040018750000084002090300010102 360000612701180301041818760000084502370300060002 370000643813200301040018770000093602250300060102 380000679805180301040018780000095702250301060002 390000707115150301041518790000099102360301010118 400000729701120301040018800000099802360301060102 8100001056183603010601021250000290102250301062618 8200001121020003010218021260000293002010301060100 8300001182020203000601021270000293202250301061518 8400001251022803010601001280000303902080301010918 8500001283020203010601181290000311102080301011500 8600001312022803010601021300000311702180301010118 8700001331020203010115021310000312702080301010115 8800001467020203010601021320000316718080301060118 8900001478020203010101021330000336802080301061518 9000001500023603010101021340000337602080301060118 9100001530022503010101021350000355902080302010102 9200001547022103010100001360000356102080301061818 9300001553022403010601021370000358602080301060818 9400001581023503010101021380000365602080301061618 9500001599023103010604021390000367802080301011102 9600001601023603010624021400000420002190301061400 9700001665023603010602021410000420302190301011402 9800001768022503010624021420000422802190301061502 9900001785022503010101021430000426702080301060024 10000001812022503010600001440000426802080301060012 10100001818022503010618021450000431402080301060011 10200001897022503010110021460000436802080301060009 10300001951022503010618001470000441502080301060006 10400001987023603010304021480000458002080301060023 10500002023022503010300021490000467702080301060020 10600002032023603010301021500000470402080301060019 10700002062023603010618181510000480002080301010021 10800002142020003010300021520000486302080301060008 10900002155023603010618021530000486600080001000022 11000002231023603010616021540000488100080201060022 11100002368023603010615181550000498502080301060013 11200002385023603010607021560000500800080301030005 11300002416023603010604181570000516900080301060010 11400002502023603010618001580000519100080101030005 11500002530023603010112021590000524100080301060004 11600002583022603010600181600000524502080301060004 11700002614022503010115181610000545200080300060004 11800002628023603010627001620000547202080301010004 11900002641022503010113021630000553200080301012304 12000002651023603010115181640000558300080301012104 12100002687023603010116181650000583900080301060021 12200002712023603010607181660000603602080301062404 12300002741023603010611001670000615902080301011807 12400002800023603010600181680000617502080301061804 16900006200020803010601042030000736702080304060002 17000006234020803010618022040000736902080302062402 17100006248020803010101022050000737102080301062902 17200006253020803010300022060000739102080301060018 17300006257020803010301022070000741702080301013018 17400006310020803010101162080000743000080301010000 17500006483000800000100022090000745502080301012418 17600006484020803010124022100000746802080301012002 17700006493020803010300002110000747802080301012018 17800006523020803010600012120000747902080301010718 17900006528020803010601022130000751800080301010002 18000006557020803010107002140000756402080301012218 18100006570020803010101022150000766402080301012102 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附圖1 235份糜子的DNA分子身份證

supplement Fig.1 235 DNA molecular identification cards of broomcorn millet

Construction of DNA Molecular Identity Card of Core Germplasm of Broomcorn Millet in China Based on Fluorescence SSR

XUE YaPeng1, DING YiBing1, WANG YuZhuo1, WANG XiaoDan1, CAO XiaoNing2, SANTRA Dipak K3, CHEN Ling2, QIAO ZhiJun2, Wang RuiYun1,2

1College of Agronomy, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China;2Center for Agricultural Genetic Resources Research, Shanxi Agricultural University/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, Shanxi, China;3Panhandle Research & Extension Center, Department of Agronomy and Horticulture, University of Nebraska-Lincoln, Scottsbluff, 69361, Nebraska, USA

【Objective】As an ancient minor grain crop, broomcorn millet (L. ) is abundant in germplasm. The construction of their DNA molecular identity based on fluorescent SSR markers would provide theoretical basis and molecular detection tool for digital management of resources. 【Method】Two hundred and thirty five broomcorn millet core accessions from China were used as experimental material, polymerase chain reaction were conducted several times using the broomcorn millet specific SSR markers which developed previously by the Broomcorn Millet Crop Molecular Breeding Research Group of the Agronomy College in Shanxi Agricultural University, core markers were obtained. With the given reference genome information of broomcorn millet, the core markers were mapped on chromosomes through BLAST sequence alignment. Fluorescence (FAM/HEX) was labeled on the 5' end of the SSR primer, the genotype of the material was given by capillary electrophoresis. Using binary coding means of expression, “0, 1” was written representing the presence or absence of amplified bands, and the discrimination of the material was detected by the software ID Analysis 4.0. Decimal (0-9) coding methods were used to calculate the size of the amplified fragments so as to obtain the character string molecular identity card of the accession. Genetic diversity, genetic clustering and principal component analysis were performed using the softwares Popgene, Powermarker, MEGA and NTSYS. The two-dimensional code DNA molecular identity card of the accession was given using the two-dimensional code online software (https://cli.im/). 【Result】PCR amplification results showed that all the 235 accessions could be separated by 7 fluorescent SSR markers (RYW3, RYW6, RYW11, RYW18, RYW37, RYW43 and RYW125) combined together. BLAST results showed that RYW18 and RYW37 were distributed on Chromosome 2, located at 0.60 cM and 0.80 cM, respectively. RYW125 is located on Chromosome 4 at 10.40 cM. RYW43 and RYW6 were distributed on Chromosome 5, located at 52.80 cM and 53.00 cM, respectively. RYW11 and RYW3 were located on Chromosome 6 at 2.10 cM and 20.70 cM, respectively. Genetic diversity analysis showed that 87 alleles were detected at 7 loci among all accessions, 3 (RYW11)-25 (RYW6) alleles were detected at each locus, with an average of 12.4286. Shannon diversity index () was detected and ranged from 0.2055 (RYW18) to 2.0587 (RYW6), with an average of 1.1398. The observed heterozygosity (o) was 0.0086 (RYW11)-0.9455 (RYW18). The expected observed heterozygosity (e) was 0.0795 (RYW18)-0.7469 (RYW11). Nei’s gene diversity index () was 0.0793 (RYW18)-0.7452 (RYW6). The polymorphism information content () was 0.0334 (RYW11)-0.8071 (RYW6), with an average of 0.5185. The results of cluster analysis and principal component analysis showed that 235 accessions were classified into 8 groups. The electrophoretic bands were number coding, and 7 marker combinations were used to construct the character string and two-dimensional code DNA molecular ID of all the accessions.【Conclusion】Two hundred and thirty five broomcorn millet core germplasms from China were used as material, polymerase chain reaction and capillary electrophoresis were conducted, 7 core SSR markers were screened. With the given reference genome information of broomcorn millet, the above markers were mapped on 4 chromosomes. Used the above SSR markers, genetic diversity analysis of all accessions was conducted and genetic diversity parameters were obtained. Based on Cluster analysis, all accessions were classified into 8 groups. Principal component analysis result resolved the deviation occured in Cluster analysis. According to the principle of most accessions were tell apart using the least markers, decimal (0-9) coding methods were used to calculate the size of the amplified fragments so as to obtain the character string molecular identity card of the accession. Combined the phenotype data with the above character string, two-dimensional code DNA molecular ID of all the accessions were developed.

broomcorn millet; capillary electrophoresis; fluorescent SSR; DNA molecular identification

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.12.002

2023-02-01；

2023-04-01

國家自然科學基金（31271791）、現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-06-13.5-A16）、山西省現代農業產業技術體系建設專項資金（2023CYJSTX03-12）、山西省重點研發項目（2022ZDYF110）

薛亞鵬，E-mail：745703453@qq.com。通信作者王瑞云，E-mail：wry925@126.com。通信作者喬治軍，E-mail：nkypzs@126.com

（責任編輯 李莉）