肌球蛋白輕鏈激酶在腸梗阻發生及腸黏膜屏障損傷中的作用

王 玉,莊 波,陳曉俊,楊儀暉

(浙江大學醫學院附屬金華醫院 1.檢驗科;2.普外科,浙江 金華 321000;3.金華市第二醫院 老年科,浙江 金華 321000;4.浙江大學醫學院附屬金華醫院 病理科,浙江 金華 321000)

腸梗阻是任何原因引起的腸內容物通過障礙,是外科常見的急腹癥之一,死亡率一般為5%～10%。敗血癥是腸梗阻死亡的主要原因[1],腸道上皮黏膜屏障的破壞,緊密連接(tightjunction,TJ)的打開是敗血癥發生的重要原因之一[2-3]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)可以使肌球蛋白輕鏈磷酸化(myosin light chain phosphorylation,pMLC),促使肌動蛋白收縮,從而使腸道平滑肌收縮,增加TJ和細胞表面的張力,破壞細胞間的緊密連接,開放TJ[4-5]。國內外許多動物實驗研究[6-7]證實,MLCK在腸道中起著至關重要的作用。本研究比較腸梗阻患者的病變組織和正常組織的組織結構改變和細胞凋亡的差異,腸組織肌層和黏膜層MLCK和pMLC的表達差異,緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)的表達差異,以及腸梗阻患者手術前后血液中MLCK含量的變化,探究MLCK和pMLC在腸梗阻患者腸道及腸黏膜屏障中的作用,檢測血液中MLCK的含量對于判斷腸黏膜屏障損傷的意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年3月在金華市中心醫院因腸梗阻進行手術的患者28例為觀察組,另選取同期年齡性別相仿的健康體檢者30例為對照組。觀察組中男18例、女10例,平均年齡(57.28±6.98)歲,小腸段梗阻22例、回腸段梗阻6例。所有病例術中均見梗阻腸近段擴張,遠端狹窄,為梗阻表現;術后病理診斷符合腸梗阻表現;排除因腫瘤、單純狹窄、腸套疊、寄生蟲等非動力原因引起的梗阻。組織標本選取患者的狹窄部腸段和正常無變化腸段。對照組中男20例、女10例,平均年齡(57.83±6.83)歲;觀察組和對照組年齡、性別占比差異無統計學意義(P>0.05)。所有研究對象知情同意,本研究經過金華市中心醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 主要材料 蘇木素購自上海展云化工,倒置熒光顯微鏡購自日本的Olympus公司,TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天公司,MLCK、pMLC、ZO-1、β-actin抗體均購自英國的Abcam公司,兔二抗、鼠二抗、DAB顯色試劑盒購自中杉金橋,蛋白酶K購自德國Biofroxx公司,組織蛋白提取試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購于美國Thermo Fisher,MLCK酶聯免疫試劑盒購于上海江萊生物。

1.3 血液學檢測 采集腸梗阻患者手術前和手術后3天,以及健康體檢者的外周靜脈血5 mL,置于鈍性分離膠試管中,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測MLCK的含量。按試劑盒上的操作步驟嚴格操作,450 nm波長處測定OD值。

1.4 組織標本檢測

1.4.1 HE染色 手術切除的病變腸組織和腸旁正常組織立即置入4%多聚甲醛中固定24 h后做組織病理切片,顯微鏡下觀察腸組織病理變化情況。根據Chiu評分法評價腸道黏膜損傷等級:0為正常腸黏膜絨毛;1級為在絨毛中軸出現腸黏膜上皮下的Gruenhagen’s間隙,常常伴隨毛細血管充血;2級為來自固有膜的腸黏膜上皮抬高及腸上皮下間隙的擴張;3級為大片腸黏膜上皮抬高,絨毛向兩側倒伏,部分絨毛頂端脫落;4級為絨毛及固有膜脫落,裸露的毛細血管擴張,可見固有膜細胞成分構成增加;5級為固有膜脫變或被消化,出血或潰瘍形成。

1.4.2 Tunel 細胞凋亡檢測 嚴格按照碧云天細胞凋亡檢測試劑盒步驟進行操作,其中滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K,20 ℃～37 ℃作用20 min,滴加按說明書配置的TdT反應液50 μL,37 ℃避光孵育60 min,滴加50 μL Streptavidin-HRP標記液,37 ℃避光孵育30 min。顯微鏡下統計整張玻片相應部位細胞核被染色成深棕色的凋亡細胞數量。

1.4.3 免疫組織化學檢測 石蠟組織切片經二甲苯和不同濃度酒精脫水后,進行免疫組織化學檢測,顯微鏡下觀察MLCK和pMLC在梗阻腸段肌層和黏膜層的表達情況。

1.4.4 Western blot(WB) 檢測 手術獲得腸組織,選取病變部位和正常部位腸組織樣本,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,并用BCA蛋白濃度試劑盒測蛋白濃度,進行WB檢測,用ECL試劑盒顯影,并觀察分析蛋白表達量。

1.5 統計學方法 應用SPSS 24.0軟件處理數據。計數資料用(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;計量資料以均值±標準差表示,2組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血中MLCK含量 對照組和觀察組手術前、后外周血MLCK的含量分別為(1.52±1.16) g/L、(12.56±4.11) g/L、(2.04±0.83) g/L,三組差異有統計學意義(F=177.69,P<0.001);觀察組術后外周血MLCK的含量和正常對照組差異無統計學意義(t=0.80,P=0.423)。

2.2 腸組織病理變化 HE染色顯示,梗阻部位腸組織結構破壞,相較于正常腸組織有大量上皮細胞脫落,少量絨毛裸露,腸道黏膜損傷分級Chiu評分3級。Tunel細胞凋亡檢測顯示,腸梗阻部位組織的凋亡細胞(31.66±4.04)多于正常腸組織(1.33±1.53),差異有統計學意義(t= -12.16,P<0.05)。見封三圖3。

2.3 MLCK和pMLC在梗阻腸段肌層和黏膜層的表達水平 免疫組化檢測顯示,梗阻部位腸組織肌層和黏膜層MLCK、pMLC的表達均高于正常腸組織,差異有統計學意義(均P<0.01)。見封三圖4、5。

2.4 梗阻段MLCK、pMLC、ZO-1的表達水平 WB檢測結果顯示,相較于正常腸段,梗阻段的MLCK(0.7632±0.3423)、pMLC(0.6399±0.2239)表達升高,ZO-1表達(0.1445±0.1430)降低,差異均有統計學意義(t=-30.145、10.793、-13.807,均P<0.01)。見圖1。

注:**P<0.01。圖1 MLCK、pMLC、ZO-1的 WB檢測結果(A)和灰度比值統計柱狀圖(B)Figure 1 WB detection results (A) and histogram of gray ratio statistics (B) of MLCK、pMLC、ZO-1

3 討論

MLCK是一種依賴于Ca2+-鈣調蛋白的激酶,存在于不同組織中,其中平滑肌MLCK負責肌肉收縮的啟動,決定其最大縮短速度和最大縮短能力,當Ca2+濃度升高時,通過催化MLC磷酸化激活橫橋ATP酶,興奮肌肉收縮偶聯,使細肌絲向粗肌絲滑行,進而產生收縮效應[8]。腸梗阻是多種原因引起的腸道內容物通過障礙,按病因可分為機械性腸梗阻、動力性腸梗阻、血運性腸梗阻,按照腸壁血循環可分為單純性腸梗阻和絞窄性腸梗阻。動力性腸梗阻的患者腸道蠕動功能喪失或腸道痙攣是其產生腸梗阻的原因。本研究選取腸梗阻手術患者為觀察對象,術后病理結果排除因腫瘤、單純狹窄、腸套疊、寄生蟲等非動力原因引起的梗阻,可以更好地說明單純腸梗阻發生時MLCK的作用。

本研究HE染色可見梗阻腸道上皮細胞凋亡增加,組織破壞,符合腸梗阻的基本病理表現。免疫組化發現MLCK及pMLC在腸梗阻段的肌層以及黏膜層表達均升高,肌層的表達升高證明腸梗阻發生時腸道處于收縮痙攣的狀態,這是造成內容物不能正常通過的原因,和國內外眾多學者通過動物或細胞實驗研究MLCK在腸梗阻中的作用結果相似[9-10]。

腸道黏膜層的表達升高可能和腸黏膜屏障的破壞有關。國內外眾多研究表明,MLCK及pMLC在非酒精性脂肪肝、胰腺炎、炎癥性腸病等患者的腸黏膜中都存在表達升高的情況[11-13],研究者認為這和腸道黏膜屏障的破壞有關。腸黏膜屏障分為四層:生物屏障、機械屏障、免疫屏障、化學屏障[14],腸黏膜的通透性主要與機械屏障有關,機械屏障由腸上皮細胞及其連接構成,腸上皮間的連接包括緊密連接(tightjunction,TJ)、縫隙連接(gapjunction,GJ)、黏附連接(adhesionjunction,AJ)及橋粒(desmosome)等,其中TJ最重要,ZO-1是其中重要的一個蛋白。炎癥因子如TNFα、LPS等可以通過活化MLCK,引起肌球蛋白輕鏈磷酸化,使TJ打開,從而使腸黏膜屏障遭到破壞[14],我們通過免疫蛋白印跡實驗得到MLCK和pMLC在梗阻腸道表達升高而ZO-1表達降低的結果,顯示梗阻段腸黏膜緊密連接打開,黏膜屏障破壞和MLCK的作用相關。

此外,本研究還利用ELISA的方法測定腸梗阻患者手術前后外周血中MLCK的含量,并與正常體檢人群外周血中的含量進行對比,發現在梗阻發生時血液中MLCK的含量升高,當梗阻解除后含量和正常者無差異。熊莊莉等[15]曾做過哮喘患者血清中MLCK含量和肺功能的關系研究,發現在哮喘患者中MLCK高表達,且與肺功能呈正相關,她認為血液中高表達的MLCK提示其在哮喘中的作用。本研究結果間接說明通過血液中MLCK的含量可以了解腸道平滑肌和腸黏膜屏障的狀態。

綜上,本研究證實肌球蛋白輕鏈激酶在腸梗阻的發生和腸黏膜屏障破壞中起著重要作用,并且梗阻發生時血液中MLCK的含量升高,梗阻解除后含量恢復和正常對照無差異,對于后期研究腸梗阻早期診斷標志物,判斷腸黏膜屏障功能是否破壞,以及抑制MLCK表達從而達到治療腸梗阻的作用提供一定的基礎。但由于本研究樣本量不夠大,以及研究方法的局限性,還需要大量的實驗來進一步研究MLCK對于腸梗阻的作用。