來氟米特干預類風濕關節炎大鼠代謝組學研究*

張欣亞，王碧瑩，賈福康，付鈺，2**

1河南中醫藥大學 藥學院，鄭州，450046；2河南羚銳制藥股份有限公司，河南信陽，465550

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種進行性骨破壞的全身免疫性疾病，其臨床特征為骨膜增殖和骨關節損傷[1]。流行病學調查結果表明[2]，RA 全球發病率約0.5%，且女性發病率高于男性。在我國貴州省部分地區RA 發病率高達9.2%，并具有30%～50%的致殘風險[3]。現代臨床研究表明[4]，RA的發生受到環境、遺傳等多重因素影響，常涉及免疫細胞過度活化、免疫細胞亞群比例失衡、自身免疫炎癥等現象[1]。RA 發病常伴隨體內代謝紊亂。研究表明，RA 患者常出現色氨酸及磷脂代謝異常[5]，體內甾體類代謝物顯著升高，出現類固醇代謝異常，而皮質類固醇的治療能夠回調甾體類代謝物的水平，使類固醇代謝趨于正常[6]。這些研究表明內源性代謝物的研究，有助于揭示RA 的發病機制，同時可輔助RA 的早期診斷及藥物評測。

來氟米特是一種具有異噁唑結構的口服免疫抑制劑，臨床用于治療RA 和系統性紅斑狼瘡等免疫性疾病，療效顯著[7，8]。研究發現[9]，來氟米特可通過抑制線粒體中二氫乳清酸脫氫酶活性，阻礙細胞合成尿嘧啶核苷，同時阻止細胞由G1 期向S 期發展，直接抑制淋巴細胞、B 細胞等免疫細胞的增殖，發揮免疫抑制作用。但來氟米特干預疾病的體內變化過程研究尚不完善。本實驗建立了牛Ⅱ型膠原（CⅡ）誘導RA 模型大鼠，利用血清代謝組學技術，監控機體在疾病狀態和受到藥物干預后的內源代謝物的水平變化，尋找機體在病理狀態下和藥物干預后差異表達的內源代謝物，探討來氟米特干預RA的關鍵代謝通路，豐富來氟米特基礎研究，并為RA的治療策略和藥物開發提供實驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

超高液相-四極桿飛行時間串聯質譜（美國Agilent 公司，6546 UPLC-Q-TOF-MS 系統），Centrifuge 5810R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）。

1.2 主要藥品和試劑

造模劑采用牛Ⅱ型膠原（批號20021，規格10mg/瓶）、弗氏完全佐劑（批號7001，規格5 mL/瓶）、不完全佐劑（批號7002，規格5 mL/瓶）均購自美國Chondrex 公司；來氟米特片（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，國藥準字H20000550，規格10 mg/片）；IL-1β、IL-6ELISA 試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司，批號EK301BHS-96、EK306HS-96）；IgG ELISA盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號EEL-R0518c96T）。

乙腈、甲醇、異丙醇為色譜級試劑（美國ThermoFisher 公司，批號A998-4、A452-4、A451-4），純水（屈臣氏公司，規格600 mL/瓶）。

1.3 實驗動物的分組、造模及給藥

SPF 級Wistar 雌性大鼠，體重180～220 g，購自北京維通利華公司，動物生產許可證編號SCXK（京）2019-0009。飼養過程中大鼠自由攝食攝水，適應性喂養1 周后開始實驗。實驗過程符合河南中醫藥大學實驗動物倫理要求（DWLL20210631）。

隨機選取6 只大鼠為空白組，其余20 只大鼠按照文獻方法[10]建立RA 模型。將完全佐劑與不完全佐劑按3∶1 比例混勻，加入CⅡ膠原，乳化完全后作為造模劑備用。于大鼠尾根部皮內注射0.15 mL造模劑完成首次免疫。首次免疫7 天后，造模大鼠尾部皮內注射0.10 mL 造模劑進行二次免疫，每天觀察造模大鼠狀態，根據RA 評分法細則進行評分（RA 評分達到2 分則造模成功）[11]。剔除未成模大鼠，將造模成功的大鼠隨機被分為模型組和來氟米特組，每組各6 只。

將來氟米特片破碎并制成混懸液用于灌胃。按照來氟米特臨床用藥劑量，換算成大鼠灌胃劑量，前3 天5.25 mg·kg-1，后維持2.1 mg·kg-1，每天灌胃一次。正常組、模型組分別給予等體積0.9%生理鹽水，每天灌胃一次。實驗持續給藥21 天。

1.4 大鼠各組關節炎腫脹度評價

本實驗使用RA 評分法、排水法和游標卡尺法量化評價各組大鼠關節腫脹度。

RA 評分法：二次免疫結束后，每7 天觀察一次大鼠關節外觀。關節炎的嚴重程度采用5 級評分量表評分[12]：踝關節到整個足腫脹4分，腳趾到踝關節腫脹3分，腳趾和腳趾關節腫脹2分，腳趾小關節紅斑或腫脹1分，無紅斑或腫脹為0 分。每只大鼠的評分為四肢之和，最高關節炎評分為16 分。

排水重法[13]：在大鼠腳踝處使用記號筆標記一條線，以保證每次稱重均在此線上。在天平上放置一個裝水的燒杯，手持大鼠使其腳踝沒入水中至與線平齊，此時天平示數即為大鼠關節腫脹程度。

游標卡尺法[14]：使用游標卡尺測量大鼠足底到腳踝面的高度，量化大鼠關節炎腫脹。

1.5 免疫功能測試

大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 水平測定：各組大鼠腹腔主動脈取血，并于4℃離心機中8000 r·min-1離心10 min，收集血清，-80℃冰箱保存。采用酶聯免疫法測定IL-1β、IL-6 和IgG 水平，具體操作按試劑盒說明進行。

大鼠脾指數評價：實驗第21 天記錄大鼠體重。將各組大鼠脾臟完整取出，稱量重量并記錄。按照脾指數=脾重（mg）/體重（g）計算出各組大鼠脾指數。

1.6 踝關節病理切片染色

剪下各組大鼠的腳踝，剃去肌肉組織，于多聚甲醛中固定24 h，后轉移至脫鈣液中脫鈣。脫鈣完成后進行脫水、包埋、切片、HE 染色和番紅固綠染色。使用顯微鏡對切片結果進行觀察。

1.7 代謝組學分析

1.7.1 血清樣品前處理 取大鼠血清100 μL，加入乙腈使蛋白沉淀完全后，置于4℃離心機13 000 r·min-1離心10 min，取上清在真空濃縮儀中干燥，加入80%甲醇-水溶液50 μL 復溶，離心10 min，取上清液進樣。各組血清樣品各取50 μL 混合，按照上述方法制成質量控制（quality control，QC）樣品，用于實驗過程中的儀器穩定性的分析。

1.7.2 代謝組學液質條件 色譜條件：色譜柱：安捷倫Proshell 120 EC18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。以0.1%甲酸水為水相（A），乙腈為有機相（B），行梯度洗脫：0～2 min，5%B；2～3 min，5%→10%B；3～10 min，10%→20%B；10～20 min，20%→100%B；20～22 min，100%B。流速0.3 mL·min-1，自動進樣器溫度4℃，進樣量1 μL，柱溫箱溫度25℃。

質譜條件：采用正、負離子模式采集質譜數據。毛細管電壓3500 V（正）和4000 V（負），噴嘴電壓500 V（正）和1000 V（負），鞘氣流速9 mL·min-1，溫度350℃；氮氣流速11 mL·min-1，毛細管溫度320℃，質量掃描范圍50～1500 m/z。

1.7.3 代謝組學數據分析 處理完成的血清樣品按照色譜質譜條件進行數據采集，利用Profinder 10.0 軟件（美國Agilent 公司）對數據進行峰提取及峰對齊等處理，再運用MassHunter Profinder Profile 8.0 軟件進行Frequency 篩選，得到由保留時間、峰面積和Mass 值構成的三維數據，完成后導入Simca P 14.1 軟件（瑞典Umetrics 公司）進行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial leastsquares discrimination analysis，OPLS-DA）。

首先，運用PCA 分析法對各組樣品進行區分。再分別對各組進行OPLS-DA 分析，以變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）＞1且單因素方差分析P ＜0.05 作為標準，篩選出潛在差異代謝物。再將質譜數據導入Metlin 數據庫進行匹配，篩選出得分＞80 的化合物，并與HMDB、KEGG、Pubchem、Massbank 等多個在線數據庫進行對比，根據二級質譜離子碎片和化學鍵斷裂規律來推斷其結構。最后，將差異代謝物輸入到Metabo-Analyst 5.0 在線數據庫中，利用pathway analysis 富集疾病通路，推斷疾病誘發體內代謝變化及藥物干預的代謝通路。

1.8 統計學方法

使用GraphPad prism 7.0 采用單因素方差分析對數據進行顯著性差異分析，符合方差齊性的采用最小顯著差異法（least-significant difference，LSD），不符合方差齊性的采用Dunnett's T3 法。

2 結果

2.1 各組大鼠關節腫脹評價

造模成功后，模型組大鼠出現小關節腫脹，伴有局部皮膚變紅發熱，隨病情發展大鼠踝關節腫脹明顯。病程后期，模型組大鼠關節嚴重腫脹，行動減少，整體呈炎癥紅腫狀。與模型組相比，來氟米特組大鼠關節腫脹情況明顯減輕，局部關節處仍伴有炎癥腫脹現象（圖1A）。

圖1 踝關節外觀狀態（A）；RA 得分（B）；排水重法（C）及游標卡尺測量法（D）量化腫脹度結果（，n=6）

本實驗采用RA 評分法、排水重法和游標卡尺測量法量化各組大鼠關節腫脹度（圖1B～D）。實驗開始14天，與空白組相比，模型組大鼠RA 得分顯著上升。實驗開始21天，與模型組相比，來氟米特組大鼠RA 得分開始下降（P ＜0.01），腫脹度顯著降低（P ＜0.01）。以上結果說明給藥后大鼠關節腫脹減輕。

2.2 各組大鼠病理切片結果

HE 染色和番紅固綠染色結果（圖2）顯示，空白組關節邊緣清晰，未見血管翳增生和關節侵蝕。與空白組相比，模型組大鼠關節處軟骨增生，并侵蝕軟骨及骨小梁，少量覆于軟骨表面形成血管翳，骨關節被破壞，關節腔內可見炎癥細胞浸潤且細胞基質流失嚴重。與模型組相比，來氟米特組給藥后在骨侵蝕和血管翳的形成上均有一定程度緩解。

圖2 各組大鼠踝關節的HE 染色切片和番紅固綠染色切片結果

2.3 各組大鼠脾指數分析

對各組大鼠的脾指數進行統計分析（圖3）。與空白組相比，模型組大鼠的脾指數有顯著增加（P ＜0.01）。與模型組大鼠相比，來氟米特組脾指數有降低趨勢，但不具備統計學意義。

圖3 各組大鼠脾指數結果（n=6）

2.4 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 水平

與空白組相比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和IgG 含量均顯著升高（P ＜0.01）。與模型組相比，來氟米特組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和IgG 含量均顯著降低（P ＜0.01）。結果見圖4。

圖4 各組大鼠血清中的IL-6（A）、IL-1β（B）及IgG（C）水平（n=6）

2.5 多元統計分析

將各組血清樣品按照“1.7.1”項下方法處理后，經過UPLC-Q-TOF-MS 分析，得到總離子流（total ion current，TIC）圖（圖5）。

圖5 空白組（A）、模型組（B）及來氟米特組（C）的TIC圖

各組數據進行峰提取、峰對齊和峰過濾操作后，得到由保留時間、Mass 值和峰面積組成的三維數據矩陣，利用SIMCA P 14.1 軟件進行多元統計分析。首先使用PCA 對各組進行無監督判別分析。在負離子模式下，模型組與給藥組數據重疊性較大，說明在負離子模式下所檢測化合物不能體現給藥后大鼠體內內源性化合物的改變情況；而在正離子模式下，給藥組和模型組有較為明顯的區分（圖6A），說明藥物干預的內源性化合物在正離子模式下有較強的響應，其中R2X 為0.551，說明該PCA 模型可信度高。故在本論文采用正離子模式下所采集數據進行后續分析。PCA 得分圖表明，QC 樣品聚合良好，說明儀器在數據收集過程中穩定，數據可信。空白組、模型組和來氟米特組之間能區別開，各組的代謝輪廓存在差異。

圖6 各組PCA 分析（A）；空白組和模型組的OPLS-DA分析（B）及OPLS-DA 模型驗證結果（C）；模型組和來氟米特組的OPLS-DA分析（D）及OPLS-DA 模型驗證結果（E）

2.5.1 差異代謝物篩選 為區分各組間的特征變量，獲得組間差異信息，采用OPLS-DA 分析空白組和模型組的差異（圖6B），兩組數據能夠明顯地區分為兩類，說明兩組之間存在明顯差異。對該模型進行200 次置換檢驗，檢驗結果如圖6C 所示，Q2和R2左側低于最右側，且Q2交于Y 軸原點以下，說明該模型擬合結果良好，可信度高。在此模型中，R2Y和Q2Y 分別為0.997 和0.781，說明該模型的解釋能力和預測能力均良好。在VIP>1 和單因素分析（P<0.05）共同篩選下，通過Metlin 等多個數據庫檢索鑒定，共指認出51 種與疾病密切相關的差異代謝物，具體信息見表1。為直觀展示出這些差異代謝物在空白組和模型組中含量分布差異，使用熱圖進行結果展示（圖7A）。將內源代謝物的HMDB 號帶入MetaboAnalyst 5.0 在線數據庫進行pathway analysis，并篩選出P<0.05 的代謝通路。結果如圖7B 所示，說明牛CⅡ誘導的大鼠RA 模型可引起類固醇激素類生物合成、鞘脂代謝和嘌呤代謝的異常。

表1 疾病相關差異代謝物信息

表2 來氟米特干預類風濕關節炎疾病的內源差異性代謝物信息

圖7 空白組和模型組差異代謝物熱圖（A）；RA 代謝通路（B）

其次，模型組和來氟米特組進行OPLS-DA 分析（圖6D），自動擬合建立代謝輪廓。該模型中R2Y 和Q2Y 參數分別為0.998 和0.736，說明該模型預測能力和解釋能力強。對該模型進行200 次置換檢驗，檢驗結果如圖6E 所示，Q2和R2左側均低于最右側，且Q2交于Y 軸原點以下，說明該模型擬合結果良好，進一步判斷該模型結果可信。在前期篩選的51 個疾病相關差異代謝物的基礎上，根據VIP ＞1 和單因素分析（P ＜0.05）進行再次篩選。結果表明，來氟米特顯著回調了14 種內源性代謝物，具體信息見表1～2。對14 個差異內源標記物在各組中的相對含量進行分析（圖8）。與空白組相比，除melatonin外，其余13 個內源化合物的相對含量在模型組中顯著升高，來氟米特給藥后顯著降低。

圖8 14 種內源代謝物在各組的相對含量

2.5.2 代謝通路分析 來氟米特回調的內源化合物的HMDB 號投入Metaboanalysis 5.0 在線網站中進行通路分析，并根據impact>0 篩選。結果顯示來氟米特主要調控了谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸代謝，還參與了花生四烯酸及嘌呤的代謝網絡調控，從而發揮對RA 模型大鼠的保護作用。

3 討論

本文關節炎指數、血清指標結果均說明來氟米特對類風濕關節炎大鼠有顯著保護作用。

代謝通路分析結果顯示，蛋氨酸通過轉硫基途徑代謝產生半胱氨酸，半胱氨酸又是谷胱甘肽的合成的必需底物，這一過程是谷胱甘肽合成速率的主要限制因素[15，16]。在本實驗中，S-adenosylhomocysteine 是蛋氨酸轉硫基代謝途徑中的重要中間產物，與空白組相比，S-adenosylhomocysteine 在模型組中含量異常升高，蛋氨酸轉硫代謝途徑異常，谷胱甘肽合成受到影響。谷胱甘肽代謝過程產生了大量的還原緩沖劑和抗氧化劑，維持人體細胞的正常生理活動[17]。模型組中NADPH和S-adenosylhomocysteine 含量異常升高，谷胱甘肽代謝、半胱氨酸和蛋氨酸失衡，是RA 大鼠體內氧化和抗氧化機制紊亂，細胞和組織發生氧化應激反應的重要表現。氧化應激過程伴隨氧化自由基和活性氧的大量產生，同時促進關節腔內炎癥反應發展。自由基可降解關節蛋白導致關節損傷[18]，活性氧會攻擊細胞內的蛋白質、脂質等，導致細胞功能障礙，最終導致RA 關節損傷[19，20]。來氟米特調控半胱氨酸和蛋氨酸代謝、谷胱甘肽代謝，可緩解RA 自身免疫導致的氧化應激，減輕細胞和組織損傷。

色氨酸及其代謝產物與自身免疫疾病密切相關，人體內95%以上色氨酸經由犬尿氨酸代謝途徑、5-羥色胺代謝途徑代謝。在犬尿氨酸代謝途徑中，色氨酸由吲哚胺吡咯2，3-加氧酶催化分解產生犬尿氨酸，后者由于其具有捕獲氧自由基的特性，被稱為內源抗氧化劑[21]。在5-羥色胺代謝途徑中，5-羥色胺由色氨酸代謝產生，對多種免疫細胞有直接或間接作用。5-羥色胺作為melatonin 的前體，促進巨噬細胞M1 極化過程中分泌IL-6 和TNF-α 等多種炎癥因子，促進破骨細胞的分化，破壞破骨細胞和成骨細胞之間的平衡，導致骨穩態失衡，造成骨破壞[22]。5-羥色胺還能刺激巨噬細胞和成熟樹突狀細胞釋放超氧化物和多種炎癥因子，加重炎癥反應[23]。在模型組中，5-羥色胺代謝轉化生成melatonin 途徑受阻，來氟米特干預后，5-羥色胺代謝途徑恢復正常，緩解關節炎癥和損傷。

環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）是嘌呤代謝通路中的重要代謝產物。有實驗證明，cGMP 的含量異常升高與RA 大鼠的痛敏行為如行走障礙、患側足趾抬起等密切相關[24]。花生四烯酸及其代謝產物在RA 患者體內表達升高，并刺激RA 關節的炎癥過程，介導關節破壞[25，26]。白三烯D4（leukotriene D4，LTD4）是由花生四烯酸通過5-脂氧合酶代謝產生的關鍵代謝物，可以增加血管的通透性，增加局部炎癥關節的滲出，加劇關節損傷。LTD4 和其他炎癥介質LTC4 和LTB4，可加劇RA 的疼痛反應[27]。來氟米特通過回調環磷酸鳥苷和LTD4的水平，調控嘌呤代謝和花生四烯酸代謝，對RA 的炎癥和疼痛的緩解有重要意義。

本研究通過血清代謝組學，從機體在生理和病理不同狀態下的內源化合物變化，闡述來氟米特干預RA 的機制。來氟米特作為免疫抑制劑，通過調控炎癥和免疫反應中多種炎癥因子的釋放，干預谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸、花生四烯酸、色氨酸及嘌呤代謝，發揮保護作用。代謝組學提供的病理條件下的異常代謝產物信息，可為類風濕關節炎的預防與治療提供參考。