HPLC-PDA雙波長法同時測定復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中富馬酸酮替芬等5個成分的含量*

蔡亮亮，王欽，徐蕾，金智華，徐安保

1南通大學(xué)附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，南通 226001；2南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院 藥學(xué)院，泰州 225300；3南通大學(xué)附屬醫(yī)院 門診部，南通226001

復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液為南通大學(xué)附屬醫(yī)院的院內(nèi)自制制劑，處方組成為富馬酸酮替芬1 g、鹽酸麻黃堿5 g、呋喃西林0.2 g、紫蘇籽油1 mL，其余為藥用輔料，加水至1000 mL。臨床主要用于治療過敏性鼻炎，效果顯著。該復(fù)方制劑的原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅檢測富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林的含量，未檢測紫蘇籽油中亞麻酸、亞油酸的含量。《中華人民共和國糧食行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》 中報道紫蘇籽油中的主要成分是亞麻酸、亞油酸，有益于人體健康[1]。因此有必要在制劑中控制亞麻酸、亞油酸的含量。目前已有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法（HPLC）分別檢測富馬酸酮替芬[2]、鹽酸麻黃堿[3]、呋喃西林[4]、亞麻酸[5]、亞油酸[5]的含量；也有采用HPLC 法同時檢測富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿與呋喃西林的含量的報道[6]；但未見采用HPLC 法同時檢測富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、亞麻酸、亞油酸含量的報道。因此，為了全面控制復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液的質(zhì)量，確保臨床用藥安全，本研究建立了HPLC-PDA 雙波長法同時檢測復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的含量，并且對該方法加以驗(yàn)證。

1 儀器與試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀（光電二級陣列檢測器PDA，日本島津儀器有限公司）；Cary-300 型紫外可見分光光度計（美國安捷倫科技有限公司）。富馬酸酮替芬（批號100230-201904，含量99.9%）、鹽酸麻黃堿（批號171241-201809，含量100.0%）、呋喃西林（批號101167-201001，含量99.4%）、亞麻酸（批號111631-202006，含量98.0%）、亞油酸（批號111622-202105，含量99.6%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純（德國默克公司）；其它試劑為分析純。復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液（批號20220608、20220725、20220906）由南通大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna-C18柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；檢測波長205 nm、370 nm；柱溫40℃；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。流動相A：0.1%磷酸水溶液-乙腈（90∶10，V/V），流動相B：乙腈；梯度洗脫（0～2 min，5%→5%B；2～20 min，5%→35%B；20～21 min，35%→95%B；21～35 min，95%→95%B；35～36 min，95%→5%B；36～45 min，5%→5%B）。在該色譜條件下，本制劑中5 種主要成分與其他相鄰峰分離度應(yīng)符合要求（r ＞1.5）。理論塔板數(shù)按富馬酸酮替芬計算不低于5000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 按照復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液處方配比分別稱取富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、亞麻酸、亞油酸對照品適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL 含富馬酸酮替芬2.5 mg、鹽酸麻黃堿12.5 mg、呋喃西林0.5 mg、亞麻酸1.5 mg、亞油酸0.75 mg 的儲備液。精密移取上述儲備液1mL，置5mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL 含富馬酸酮替芬0.5mg、鹽酸麻黃堿2.5mg、呋喃西林0.1 mg、亞麻酸0.3 mg、亞油酸0.15 mg 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液2.5 mL，置于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，振蕩混勻。離心取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液處方配比及制備工藝，制成不含富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、紫蘇籽油的陰性樣品。再按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制得陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下的陰性樣品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液10 μL 進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖（圖1）。富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、亞麻酸、亞油酸出峰時間分別為4.224、10.598、16.382、29.613、30.916 min，這5 個成分與相鄰峰的分離度均大于1.5，表明復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻中其它成分不干擾5 個主成分的檢測，方法專屬性良好。

圖1 混合對照品于205 nm（A）及370 nm（B）、供試品于205 nm（C）及370 nm（D）、陰性樣品于205 nm（E）及370 nm（F）HPLC圖

2.3.2 線性與范圍 以復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液5個成分在供試品溶液中的濃度為100%，考察5 個主成分在50%～150%濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。分別精密量取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對照品儲備液0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL 置于5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，取各溶液10 μL 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的線性關(guān)系

2.3.3 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8、12 h 取樣檢測，記錄色譜圖。結(jié)果5 個成分峰面積RSD 分別為0.28%、1.12%、1.25%、1.63%、1.75%，表明供試品溶液室溫放置12 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取5 個成分的混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，連續(xù)測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果5 個成分峰面積RSD 分別為0.56%、1.28%、0.73%、1.15%、1.65%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分別制備6 份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別配制2 份混合對照品溶液。精密量取供試品溶液與混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積分別計算復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5個成分的含量及RSD 值。結(jié)果5 個成分的平均含量分別為1.089、4.982、0.214、0.582、0.185 mg·mL-1；RSD 分別為1.42%、1.62%、1.35%、1.71%、1.43%，這表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.6 中間精密度試驗(yàn) 按“2.3.5”項(xiàng)下方法另配制6 份的供試品溶液，另按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別配制2 份混合對照品溶液。由不同分析人員用不同儀器，在不同日期按同法進(jìn)行檢測，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積分別計算富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的含量及RSD 值。結(jié)果12 份樣品中5 個成分的平均含量分別為1.036、5.051、0.209、0.592、0.187 mg·mL-1；RSD 分別為1.29%、1.17%、1.49%、1.55%、1.85%，表明該方法的中間精密度良好。

2.3.7 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取處方量80%、100%、120%的富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、亞麻酸、亞油酸適量，加入“2.2.3”項(xiàng)下陰性樣品溶液，模擬配制復(fù)方酮替芬滴鼻液；按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成供試品溶液，每個濃度各3 份。另照“2.2.1”項(xiàng)下方法分別配制2 份混合對照品溶液。精密量取供試品溶液與混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積分別計算復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的含量，計算回收率及RSD 值。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的回收率

2.3.8 樣品檢測 取3 批富馬酸酮替芬滴鼻液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另按“2.2.1”項(xiàng)下方法分別配制2 份混合對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積分別計算5 個成分的含量。結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中5 個成分的含量（mg·mL-1）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

分別取富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、呋喃西林、亞麻酸、亞油酸對照品適量，精密稱定，用甲醇分別稀釋至約10 μg·mL-1，于200～400 nm 范圍內(nèi)掃描，紫外光譜圖見圖2。結(jié)果顯示富馬酸酮替芬、鹽酸麻黃堿、亞麻酸、亞油酸在205 nm 處均有較強(qiáng)的響應(yīng)，但是呋喃西林在205 nm 處響應(yīng)弱，370 nm 處響應(yīng)較強(qiáng)。復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液的處方組成中由于呋喃西林用量最小，為確保這5 種成分均能得到較好的響應(yīng)，因此采用雙波長（205、370 nm）同時檢測本制劑中5 種成分的含量。

圖2 紫外光譜圖

3.2 供試品溶液制備方法的選擇

復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中的5 個成分，在甲醇中具有不同的溶解度，其中富馬酸酮替芬、亞麻酸、亞油酸溶于甲醇；鹽酸麻黃堿既溶于水，也可溶于甲醇；呋喃西林微溶于甲醇，極微溶于水。因此，為使這5 個成分均有好的溶解性，選擇甲醇作為供試品溶液制備的溶劑。按處方配比計算，鹽酸麻黃堿濃度約為5 mg·mL-1，呋喃西林濃度僅為0.2 mg·mL-1，濃度相差較大，若直接進(jìn)樣，鹽酸麻黃堿進(jìn)樣量會超過柱容量，且峰形不好。因此，考慮對樣品溶液稀釋處理再進(jìn)樣。樣品溶液用甲醇稀釋2 倍后進(jìn)樣，鹽酸麻黃堿峰形有明顯改善，且其它4 個成分均可以檢測到。因而，用甲醇對樣品溶液稀釋2倍，作為本品供試品溶液的制備方法。

3.3 流動相的選擇

本試驗(yàn)分別考察了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸6 組流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸為流動相時，5 個成分峰形較好，且基線平穩(wěn)，因此選為流動相。方法建立之初，擬采用等度洗脫的方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞麻酸、亞油酸在色譜柱上具有強(qiáng)保留的性質(zhì)，這5 個成分保留值相差較大，因此考慮梯度洗脫[7]，并確定梯度洗脫程序。在此條件下，復(fù)方富馬酸酮替芬滴鼻液中的5 個成分均能得到較好的分離，且保留時間適宜。