HPLC法同時(shí)測(cè)定宮血停顆粒中六種成分的含量

胡生俊，朱昱，陳娟

宿遷市食品藥品檢驗(yàn)所，宿遷223800

宮血停顆粒是由黃芪、益母草、女貞子、升麻、枳殼、當(dāng)歸等11 味藥材經(jīng)水提醇沉工藝加工而成的中藥復(fù)方制劑，具補(bǔ)益脾腎，活瘀止血的功效，用于脾腎兩虛，氣虛血瘀而致的月經(jīng)過(guò)多及崩漏。崩漏是婦人在更年期及青春期均常見(jiàn)的疾病，臨床治療存在復(fù)發(fā)率高和副作用明顯等特點(diǎn)，宮血停顆粒既有中藥?kù)`活多變的特點(diǎn)，而又服用方便，治療婦人脾腎虧虛型崩漏療效滿意[1]。宮血停顆粒現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第十七冊(cè)，檢驗(yàn)項(xiàng)目?jī)H有兩項(xiàng)化學(xué)反應(yīng)[2]，無(wú)法有效控制藥品質(zhì)量，且僅見(jiàn)HPLC-ELSD 法測(cè)定該藥中黃芪甲苷含量的文獻(xiàn)報(bào)道[3，4]。本文采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定宮血停顆粒中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、異阿魏酸、特女貞苷、柚皮苷、新橙皮苷的含量，分別作為指標(biāo)成分以反映處方中黃芪、當(dāng)歸、升麻、女貞子、枳殼5 味藥材的質(zhì)量及投料情況，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，為宮血停顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate3000 液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器）、Chromeleon7 色譜工作系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司、XPE205DR 電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）、Milli-Q 超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）等。

1.2 試藥

宮血停顆粒3 批（陜西步長(zhǎng)高新制藥有限公司，批號(hào)20220521、20220708、20221115）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)111920-201907，純度96.8%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201915，純度99.4%）、異阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)111698-201904，純度99.3%）、特女貞苷對(duì)照品（批號(hào)111926-201906，純度95.0%）、柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)110722-202116，純度93.5%）和新橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)111857-201804，純度99.4%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)默克公司）；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～15 min，15% A；15～20 min，15%→20% A；20～25 min，20% A）；柱溫35℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品約14 mg、阿魏酸對(duì)照品約14 mg、異阿魏酸對(duì)照品約14 mg、特女貞苷對(duì)照品約46 mg、柚皮苷對(duì)照品約86 mg、新橙皮苷對(duì)照品約75 mg，精密稱定，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液2 mL，置20 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇約40 mL，超聲處理（功率300 W，頻率45 kHz）30 min，放冷，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 依照處方，分別制備不含黃芪、當(dāng)歸、升麻、女貞子、枳殼的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證[5]

2.3.1 系統(tǒng)適用性及專屬性考察 分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，6 種成分峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于8000。供試品色譜圖種出現(xiàn)與對(duì)照品溶液中6 種成分保留時(shí)間一致的色譜峰，且相應(yīng)的二極管陣列檢測(cè)器（DAD）光譜也一致。阿魏酸作為當(dāng)歸和升麻共有成分[6]，在缺當(dāng)歸的陰性樣品圖1D 和缺升麻的陰性樣品圖1E 中均檢出阿魏酸成分，其他陰性樣品中在相應(yīng)指標(biāo)成分位置均未檢出色譜峰，表明本法專屬性良好。

圖1 宮血停顆粒對(duì)照品溶液（A）、供試品溶液（B）、黃芪（C）、當(dāng)歸（D）、升麻（E）、女貞子（F）、枳殼（G）陰性樣品溶液HPLC 色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備液2 mL，分別置5、10、20、50、100、200 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。將上述6份系列濃度對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積（Y，mAU*s）為縱坐標(biāo)，濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到6 種成分的回歸方程及線性范圍（n=6），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 儀器精密度考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6 種成分的峰面積RSD 值分別為0.86%、1.05%、0.93%、0.57%、0.65%、0.37%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性考察 取同一批宮血停顆粒6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算6 種成分的含量結(jié)果，結(jié)果顯示，6 種成分的含量結(jié)果RSD 值分別為0.53%、0.47%、0.29%、0.66%、0.37%、0.41%（n=6）。三名實(shí)驗(yàn)人員分別對(duì)同一批宮血停顆粒進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示6 種成分的含量結(jié)果RSD值分別為1.24%、0.95%、0.83%、1.02%、0.29%、0.53%（n=3）。表明方法的重復(fù)性和中間精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6 種成分的峰面積RSD 值均小于2.0%（n=6），表明各成分在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率考察 取已知含量的宮血停顆粒（批號(hào)20220521）6份，研細(xì)，精密稱取1 g，置50 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液2.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，用實(shí)測(cè)值與供試品含有量之差，除以對(duì)照品加入量計(jì)算各成分加樣回收率和RSD（n=6），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分加樣回收率

2.3.7 耐用性考察 使用兩種不同液相色譜儀（Thermo UltiMate3000、Agilent 1260II），三種不同品牌相同長(zhǎng)度及填料的液相色譜柱（Agilent TCC18、Diamonsil C18、Supfex JX-C18），采用外標(biāo)法對(duì)同一份樣品中6 種成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果6 種成分的含量結(jié)果RSD 值均小于2.0%（n=6），各成分分離度均大于1.5。調(diào)節(jié)流動(dòng)相初始比例（乙腈占比14%、15%、16%），磷酸溶液的濃度（0.05%、0.1%、0.5%、1.0%），各成分分離情況無(wú)明顯變化，分離度均大于1.5，表明方法的耐用性良好。

2.4 樣品測(cè)定

取三批宮血停顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各成分的峰面積，采用外標(biāo)法，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 宮血停顆粒中各成分的含量（mg·g-1）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別考察了甲醇、乙腈作為有機(jī)相的流動(dòng)相體系，結(jié)果顯示，乙腈-0.5%磷酸溶液流動(dòng)相體系使各成分分離效果最佳。乙腈-0.5%磷酸溶液（15∶85）亦能使各組分完全分離，但是新橙皮苷的出峰時(shí)間較遲且理論塔板數(shù)較低，因此選擇本文中的梯度洗脫方法，使新橙皮苷出峰時(shí)間提前且理論塔板數(shù)更高。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用DAD 檢測(cè)器掃描對(duì)照品溶液色譜圖，獲得190～400 nm 各成分的光譜圖（圖2），考慮到目前國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中同一方法下少見(jiàn)多波長(zhǎng)進(jìn)行含量測(cè)定，且單一波長(zhǎng)測(cè)定可以擴(kuò)大方法適用性，故選定在225 nm 光譜下同時(shí)測(cè)定6 個(gè)成分的含量。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷（A）、阿魏酸（B）、異阿魏酸（C）、特女貞苷（D）、柚皮苷（E）及新橙皮苷（F）對(duì)照品光譜圖

3.3 供試品溶液制備方法的確定

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，考察了提取溶劑的種類以及提取方法。分別比較了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)50%甲醇、甲醇的提取效果較好，但是由于樣品中含有大量糖粉，50%甲醇制備的供試品溶液粘度大、難過(guò)濾，故選擇甲醇作為提取溶劑[7]。分別比較了不同時(shí)間的超聲提取和加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)二者提取效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異，但是超聲處理更為便捷，故選擇超聲提取30 min 作為樣品的提取方法。

3.4 檢測(cè)成分的選擇

《中國(guó)藥典》2020 年一部中以黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、當(dāng)歸中阿魏酸、升麻中異阿魏酸、女貞子中特女貞苷、枳殼中柚皮苷和新橙皮苷作為各藥材的含量測(cè)定指標(biāo)成分[6]，本文采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定6 種成分以反映處方中黃芪、當(dāng)歸、升麻、女貞子、枳殼5 味藥材的質(zhì)量及投料情況。宮血停顆粒處方中益母草藥材的指標(biāo)成分為鹽酸水蘇堿，鹽酸水蘇堿在C18色譜柱保留較弱，通常采用SCX-強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱進(jìn)行分離，故本文未對(duì)益母草進(jìn)行研究。