METTL16、MAT2A在胃癌組織中的表達及其與胃癌患者臨床病理參數、預后的關系*

秦豫培,楊 麗,胡陽黔

國藥東風總醫院/湖北醫藥學院附屬東風醫院消化內科,湖北十堰 442001

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤,全球每年發病例數達100萬例,死亡例數達78萬例,嚴重威脅人類健康[1]。胃癌早期無特異性臨床表現,多數患者確診時已進入中晚期,5年生存率較低[2]。尋找能夠早期診斷及預測胃癌預后的分子標志物具有重要意義。甲基轉移酶樣蛋白16(METTL16)是一種N6甲基腺苷(m6A)RNA甲基轉移酶,通過甲基化修飾U6小核RNA、長鏈非編碼RNA MALAT1,調控下游基因表達,影響個體生長發育及細胞凋亡等生物學過程[3]。研究發現,METTL16在肝癌等惡性腫瘤中表達上調,其通過與真核生物起始因子3a相互作用,促進翻譯起始復合物的組裝,促進下游癌基因的表達,導致腫瘤進展[4]。甲硫氨酸腺苷轉移酶2A(MAT2A)蛋白參與催化甲硫氨酸和ATP產生S-腺苷甲硫氨酸,是細胞內重要的甲基供體[5]。MAT2A在乳腺癌等腫瘤中表達上調,其通過促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和干性轉化,促進腫瘤的發生發展[6]。目前METTL16、MAT2A在胃癌中的表達水平及在預后判斷中的價值尚不明確。本研究旨在通過分析胃癌中METTL16和MAT2A的表達,探討兩者的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將本院2018年3月至2019年3月診治的92例胃癌患者納入研究。男56例,女36例;年齡33～77歲,平均(58.3±5.1)歲;分化程度:中、高分化49例,低分化43例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期40例,Ⅲ期52例;合并淋巴結轉移者53例;腫瘤最大徑:>5 cm者51例,≤5 cm者41例;病理類型:腺癌62例,腺鱗癌30例;腫瘤位置:胃竇部55例,賁門胃底部37例。納入標準:(1)經病理組織學檢查確診為胃癌;(2)初次診治,既往無手術、放化療等治療史;(3)患者及家屬配合檢查治療,臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)合并肝、腎等臟器功能衰竭;(3)妊娠及哺乳期女性。本研究經本院倫理委員會審核批準通過,納入研究者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 METTL16、MAT2A單克隆抗體均購自美國Abcam公司,貨號ab40850、ab209328。兩步法免疫組織化學染色試劑盒購自北京中杉金橋公司,貨號PV-6001。

1.3方法

1.3.1免疫組化檢測METTL16、MAT2A表達 將術中獲取的胃癌和癌旁組織用含10%甲醛的組織固定液固定過夜,常規石蠟包埋后用切片機切片,厚度4 μm,65 ℃烘箱放置2 h,用二甲苯Ⅰ、Ⅱ依次脫蠟兩遍,每次10 min,梯度乙醇(100%、95%、80%、70%、50%乙醇)水化,每個梯度5 min。檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中進行抗原熱修復,熱修復條件:水浴鍋100 ℃ 15 min。3%的過氧化氫水溶液作用15 min,消除內源性過氧化物。3%山羊血清室溫封閉2 h。滴加一抗,METTL16一抗稀釋比例1∶1 000,MAT2A一抗稀釋比例1∶2 000。4 ℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗室溫孵育2 h。癌組織DAB顯色3 min,癌旁組織DAB顯色5 min,蘇木素染核10 s。50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇脫水,每個梯度5 min,最后中性樹脂封片鏡檢。鏡下觀察染色情況,同時進行免疫組化染色評分。染色強度評分:不著色為0分,淡黃色1分,棕黃色2分,深褐色3分;染色面積評分:<25%為1分,25%～50%為2分,>50%為3分。染色強度評分與染色面積評分乘積為免疫組化染色評分,>2分為陽性,≤2分為陰性。

1.3.2隨訪 所有患者自病理確診之日起開始進行定期門診或電話隨訪,術后第1年每3個月隨訪1次,術后第2至3年每半年隨訪1次,總隨訪時間3年,隨訪內容為患者生存及腫瘤復發轉移情況,隨訪截至2022年4月1日,隨訪終點為患者死亡或隨訪結束。

2 結 果

2.1胃癌和癌旁組織中METTL16、MAT2A蛋白的表達 癌組織中METTL16黃褐色陽性染色主要位于細胞質和細胞膜,MAT2A陽性染色主要分布于細胞核。胃癌組織中METTL16、MAT2A陽性率分別為73.91%(68/92)、71.74%(66/92),明顯高于癌旁組織的METTL16、MAT2A陽性率[26.09%(24/92)、25.00%(23/92)],差異均有統計學意義(χ2=42.087、40.238,P<0.001),見圖1。Spearman秩相關分析顯示,胃癌組織中METTL16與MAT2A蛋白呈正相關(r=0.769,P<0.001)。

圖1 胃癌和癌旁組織中METTL16、MAT2A蛋白表達情況(×200)

2.2METTL16、MAT2A表達與胃癌臨床病理特征的關系 不同腫瘤TNM分期及淋巴結轉移情況的患者癌組織中METTL16、MAT2A陽性率比較,差異均有統計學意義(P<0.05),腫瘤TNM分期Ⅲ期及伴淋巴結轉移的患者癌組織中的METTL16、MAT2A陽性率分別高于腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期及無淋巴結轉移的患者癌組織(P<0.05)。不同年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤位置、病理類型、病理分級患者癌組織中METTL16、MAT2A陽性率比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 METTL16、MAT2A表達情況與胃癌患者臨床病理特征的關系

2.3METTL16、MAT2A表達與胃癌患者生存預后的關系 隨訪期間無失訪,死亡患者例數28例,3年總體生存率為69.56%(64/92)。METTL16陽性組及陰性組3年總體生存率分別為63.24%(43/68)、87.50%(21/24),平均生存時間分別為(30.26±2.33)、(33.95±2.51)個月。METTL16陽性組的生存預后差于METTL16陰性組(Log-Rankχ2=3.913,P=0.011);MAT2A陽性組及陰性組3年總體生存率分別為60.61%(40/66)、92.31%(24/26),平均生存時間分別為(29.75±2.24)、(34.87±2.63)個月。MAT2A陽性組的生存預后差于陰性組(Log-Rankχ2=4.335,P=0.002)。見圖2。

圖2 Kaplan-Meier分析METTL16、MAT2A表達與胃癌患者生存預后的關系

2.4單因素及多因素COX回歸分析影響胃癌預后的因素 以胃癌患者生存預后情況為因變量(1=死亡,0=存活),以年齡(1為≥60歲,0為<60歲)、性別(1=男,0=女)、腫瘤位置(1=胃竇部,0=胃底賁門部)、腫瘤最大徑(1為>5 cm,0為≤5 cm)、病理分級(1=中、高分化,0=低分化)、病理類型(1=腺癌,0=腺鱗癌)、腫瘤TNM分期(1=Ⅲ期,0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結轉移(1=有,0=無)、METTL16(1=陽性,0=陰性)、MAT2A(1=陽性,0=陰性)為自變量。單因素及多因素COX回歸分析顯示,胃癌組織中METTL16陽性、MAT2A陽性、腫瘤分期Ⅲ期及淋巴結轉移是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。見表2、3。

表2 單因素COX比例風險模型分析影響胃癌患者預后的危險因素

表3 多因素COX比例風險模型分析影響胃癌患者預后的獨立危險因素

3 討 論

胃癌是我國常見消化系統惡性腫瘤,每年新發病例42.4萬例,死亡病例29.8萬例[7]。目前胃癌的治療以手術治療及輔助放化療治療為主,但對于中晚期患者,即使經積極治療,仍可發生腫瘤復發或轉移,導致患者死亡[8]。因此,深入探索胃癌疾病機制,尋找能夠評估胃癌預后的腫瘤標志物,具有重要意義。胃癌的發生、發展與遺傳和環境因素有關,涉及癌基因過度激活,抑癌基因的失活及轉錄翻譯過程的異常。腫瘤中存在RNA修飾異常的現象,如m6A RNA甲基轉移酶的甲基化修飾可通過影響RNA的剪接、易位和穩定性,調節細胞發育、干細胞分化等過程[9]。

METTL16是一種m6A甲基轉移酶,通過促進RNA的m6A修飾,甲基化小核糖核苷酸U6、長鏈非編碼RNA多個靶點。METTL16在胰腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過度表達,其通過促進腫瘤細胞的惡性增殖及轉移,導致患者預后不良[10-11]。本研究中,胃癌組織中METTL16表達明顯升高,提示METTL16可能參與胃癌的腫瘤發生。研究表明,腫瘤中存在METTL16基因啟動子區擴增突變的現象,引起腫瘤細胞微衛星不穩定及腫瘤內異質性的發生,導致腫瘤的惡性進展[12]。本研究中,胃癌中METTL16的表達與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關,提示METTL16的表達升高參與促進胃癌的惡性增殖和轉移。研究表明,胃癌中METTL16的表達升高能夠促進細胞周期素激酶D1的表達,進而誘導胃癌腫瘤細胞G1期向S期轉換,導致腫瘤細胞的過度增殖[13]。此外,METTL16能夠通過甲基化修飾長鏈非編碼RNA轉移相關肺腺癌轉錄物1,激活β-連環蛋白及下游基質金屬蛋白酶9的表達,促進腫瘤血管生成擬態及血管新生,導致腫瘤細胞的轉移[14-15]。本研究發現,METTL16陽性表達的胃癌患者生存預后較差,是影響胃癌患者預后的獨立危險因素,表明檢測癌組織中METTL16的表達有助于評估患者的臨床預后。METTL16的表達升高導致順鉑等化療藥物治療敏感性降低,因而篩選能夠抑制METTL16的小分子藥物,有助于改善腫瘤患者化療耐藥的形成,這可能是新的腫瘤治療策略[16]。

MAT2A是甲硫氨酸循環中的限速酶,催化甲硫氨酸和三磷酸腺苷合成S-腺苷蛋氨酸,S-腺苷蛋氨酸作為體內的重要甲基供體,參與多胺合成等細胞代謝過程[17]。近年來發現,肝癌中MAT2A的表達上調,其可通過激活磷脂酰肌醇3激酶,促進癌基因c-MYC的表達,導致腫瘤細胞的過度增殖[18]。本研究中,胃癌組織中MAT2A表達升高,提示MAT2A可能與胃癌的腫瘤發生有關。MAT2A表達上調的機制與轉錄后調控異常有關。研究發現,腫瘤發生時環狀RNA_0044516表達異常升高,其作為分子海綿結合抑制微小RNA-361的表達及功能,導致微小RNA-361不能結合到MAT2A mRNA的3′非編碼區,MAT2A mRNA的穩定性增加,促進MAT2A的表達[19]。本研究中,MAT2A表達與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關,提示MAT2A參與促進胃癌的進展,其機制與MAT2A參與腫瘤代謝重編程有關。研究表明,MAT2A通過增加受體相互作用蛋白1基因啟動子區組蛋白H3K4甲基化水平,增加腫瘤細胞內甲硫氨酸循環活性,進而促進腫瘤相關巨噬細胞向M1型極化,促進腫瘤的免疫逃逸[20]。此外,腫瘤中MAT2A通過激活磷酸腺苷激活的蛋白激酶,促進程序性細胞死亡蛋白6的表達,進而促進腫瘤細胞的過度增殖[21]。本研究中,MAT2A陽性表達的胃癌患者生存預后較差,并且是胃癌患者不良預后的獨立危險因素,提示MAT2A的表達有助于評估胃癌患者的預后。有研究報道,胃癌中MAT2A的表達升高促進長鏈脂酰輔酶A合成酶3基因啟動子區組H3K4三甲基化,進而激活長鏈脂酰輔酶A合成酶3的表達,導致胃癌細胞鐵死亡抗性的形成,降低腫瘤細胞對順鉑等化療藥的敏感性[21-22]。因此,胃癌中MAT2A的高表達在胃癌的惡性進展中發揮重要作用,可能是胃癌治療的潛在的靶標。

本研究中,胃癌組織中METTL16與MAT2A表達呈顯著正相關,提示兩者在胃癌發生、發展過程中可能存在協同的作用。研究表明,METTL16作為甲基轉移酶,能夠與MAT2A mRNA結合,增加MAT2A mRNA的穩定性,促進MAT2A的表達[23]。但目前兩者在胃癌中的具體作用機制有待深入研究。

綜上所述,胃癌中METTL16、MAT2A表達升高,兩者表達與腫瘤TNM分期及淋巴結轉移有關,均參與胃癌的發生、發展。METTL16、MAT2A陽性表達是影響胃癌患者預后的危險因素,可作為新的反映胃癌預后的生物標志物。本研究也存在一定的不足,本研究樣本量有限,隨訪時間較短,有待今后開展前瞻性、多中心大樣本的臨床實驗來進一步完善,從而深入分析兩者在胃癌中的臨床意義。