基于高通量測序分析多巴胺受體DRD5缺失小鼠腸道菌群的變化*

劉 璐,吳昱青

1.南京醫科大學基礎醫學院免疫學系,江蘇南京 211100;2.南京醫科大學第一附屬醫院檢驗學部,江蘇南京 210029;3.國家醫學檢驗臨床醫學研究中心分中心,江蘇南京 210029

腸道菌群是定植在腸道內復雜且豐富的微生物群落。研究表明,腸道菌群在生物體內的新陳代謝、免疫系統發育、炎癥反應等方面發揮著重要作用,腸道菌群的紊亂與消化系統、免疫系統、呼吸系統、神經系統等疾病的發生密切相關[1-2]。目前研究發現帕金森患者腸道菌群紊亂并伴隨有腸道功能異常的出現[3],多巴胺的水平及其受體表達的異常與帕金森病的發生密切相關[4]。小鼠腸腔內含有由腸道多巴胺能神經元分泌產生的高濃度的多巴胺[5],多巴胺可通過多巴胺受體調控胃腸道功能,胃腸道中多巴胺水平的下降也可導致腸道微生態失衡[6],而多巴胺受體DRD5在腸道微生物穩態中扮演的角色并不十分明確。本研究擬采用高通量測序分析DRD5缺失小鼠糞便樣本的腸道菌群變化,探討DRD5在腸道微生態調控中的作用,以期為臨床診斷和治療腸道菌群紊亂提供依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 5只野生型無特定病原體級(SPF級)C57BL/6J小鼠作為對照組(購于南京醫科大學醫藥實驗動物中心)。5只DRD5敲除小鼠作為對照組(購于廣州賽業生物科技有限公司)。兩組小鼠均飼養于南京醫科大學醫藥實驗動物中心SPF級環境,實驗動物飼養設施合格證號為SYXK(蘇)2021-0023。光暗每日各半,室溫控制在(23±2)℃,相對濕度45%～70%。本研究已通過南京醫科大學動物實驗倫理委員會審查(批準編號:1707029)。

1.2方法

1.2.1小鼠糞便標本及腸道組織的收集 糞便標本的采集采取立取、立存(取樣后立即保存)原則,用無菌1.5 mL EP管收集飼養至8周齡的小鼠糞便,取樣前洗手,戴無菌手套、口罩,連續收集3次糞便,混勻。標本采集后,標記好小鼠品系、編號、采樣日期等。收集同期小鼠腸道組織,進行大體觀察,測量結腸長度,同時制備常規石蠟切片,進行HE染色,于鏡下觀察組織形態。

1.2.2DNA提取 采用糞便DNA組快速提取試劑盒進行糞便基因組DNA提取,按照試劑盒說明書操作,并檢測DNA濃度。

1.2.3DNA 16S rRNA檢測 對16S rRNA的DNA序列進行高通量測序,高通量測序及測序文庫構建由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2.4生物信息學分析 原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控,使用FLASH軟件進行拼接。通常將相似度在97%以上的序列聚類作為1個操作分類單元(OTU),并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva數據庫(SSU123),比對閾值設置為70%。

2 結 果

2.1小鼠腸組織的大體形態觀察 對照組小鼠腸組織長度、大體形態正常;敲除組小鼠腸組織水腫,長度縮短,與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注:A為對照組;B為敲除組。

2.2小鼠腸組織的鏡下觀察 結腸腸壁由內至外依次為黏膜層、黏膜肌層、黏膜下層、肌層和漿膜層。對照組小鼠腸道組織形態正常,可見明顯的隱窩和大量杯狀細胞,無炎性細胞浸潤。敲除組小鼠腸道組織結構紊亂,腸道黏膜層輕微增生,有少量淋巴細胞浸潤,見圖2。

注:A為對照組;B為敲除組;箭頭表示淋巴細胞浸潤。

2.3OTU分析 對照組小鼠和敲除組小鼠共產生OTU 443個,共有OTU 273個,其中對照組小鼠OUT 326個,敲除組小鼠390個,對照組小鼠特有OTU為53個,敲除組小鼠特有OTU為117個,明顯高于對照組小鼠,兩組比較差異有統計學意義(P<0.05),滿足歸類分析要求,見圖3。

注:A為對照組;B為敲除組。

2.4物種及其豐度分析

2.4.1門分類水平比較 門分類水平主要檢測出10個菌門,其中兩組小鼠均以擬桿菌門和厚壁菌門為優勢菌門,對照組和敲除組優勢菌門的相對豐度百分比分別為93.06%和95.10%。兩組間優勢菌門的相對豐度比較,差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組小鼠比較,敲除組小鼠中變形菌門顯著減少,藍細菌門顯著增多,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖4。

注:A為對照組;B為敲除組。

2.4.2屬分類水平比較 敲除組小鼠與對照組小鼠之間羅姆布茨菌屬、真桿菌屬、脫硫弧菌屬、ⅩⅢ_UCG-001屬、胃嗜氣科菌屬、Rs-E47_termite屬、雙歧桿菌屬、ASF356屬、布勞特菌屬、毛螺菌屬豐度比較,差異均有統計學意義(P<0.05),但除毛螺菌屬外,其他菌屬相對豐度都很低。相對豐度居于前5位的分別為擬桿菌屬、梭菌屬、丹毒絲菌屬、毛螺菌屬和彎曲菌屬,見圖5。

注:A為對照組;B為敲除組。

2.5差異細菌種類 對照組小鼠腸道菌群中彎曲菌、脫硫弧菌、紅螺菌、伯克菌以及疣微菌相對豐度較高,差異有統計學意義(P<0.05),而敲除組小鼠中顫螺菌和柔膜菌的相對豐度較高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

注:A為對照組;B為敲除組。

3 討 論

多巴胺又名3,4-二羥基苯乙胺,是中樞神經系統中一種重要的兒茶酚胺類神經遞質,負責機體的重要功能,包括情緒、認知、行為、運動控制、心血管功能和內分泌調節等,其缺失可導致帕金森病的發生[7]。多巴胺主要通過其受體發揮生物學功能,多巴胺受體包括D1類受體和D2類受體:D1類受體包括DRD1和DRD5,D2類受體包括DRD2、DRD3和DRD4[8]。目前針對多巴胺-DRD5信號的研究主要集中在其對炎癥和腫瘤等疾病的調控作用。

腸道菌群是定植在腸道內的龐大微生物群落。腸道菌群失調可導致微生物豐度、微生物構成和微生物代謝產物等發生變化,從而影響腸道或遠端器官的免疫功能,甚至影響疾病的發生發展,如“菌群-腸-腦軸”“菌群-腸-肝軸”的提出說明腸道菌群與腦、肝臟等器官及相關疾病存在密切聯系[9-10]。隨著微生物分析技術和生物信息學的發展,如高通量微生物16S rDNA基因測序技術極大地豐富了微生物的檢測手段,腸道菌群的研究進入一個新的階段[11]。本研究通過檢測對照組小鼠和敲除組小鼠腸道菌群的變化,探討DRD5與腸道菌群紊亂的關系。

本研究結果顯示,對照組小鼠和敲除組小鼠OTU數存在差異。進一步菌群差異分析發現,兩組腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種水平存在差異。敲除組小鼠與對照組小鼠相比,藍細菌門顯著增加,其數目增多可導致神經系統疾病空泡性髓鞘病的發生[12]。本研究結果發現,與對照組小鼠相比,敲除組小鼠中羅姆布茨菌豐度明顯降低。有研究報道,80%以上的肥胖患者腸道菌群中都存在羅姆布茨菌,提示羅姆布茨菌可能是超重人群中一種普遍的致病菌[13]。對照組小鼠中真桿菌的豐度顯著高于敲除組小鼠,真桿菌是屬于后壁菌門、梭菌目、真桿菌科的一類革蘭陽性菌,是人體腸道的重要組成部分。目前研究認為真桿菌可通過產生短鏈脂肪酸緩解宿主腸道炎癥、2型糖尿病和肥胖等癥狀,而且短鏈脂肪酸中的丁酸可修復腸道黏膜,抑制結直腸癌的發生[14-15]。脫硫弧菌屬增多是腸息肉和潰瘍性結腸炎的一個重要特征[16],本研究結果發現,DRD5缺失后,脫硫弧菌屬的豐度顯著下降,提示靶向抑制DRD5可降低腸息肉和潰瘍性結腸炎的發生風險。梭菌家族的ⅩⅢ_UCG-001菌屬相對豐度與血清總膽固醇、甘油三酯、血清低密度脂蛋白均呈正相關[17],DRD5缺失小鼠中ⅩⅢ_UCG-001菌屬的相對豐度均低于對照組小鼠。報道指出,在帕金森病患者中Gastranaerophilales菌屬的豐度顯著增加,提示Gastranaerophilales菌屬可能參與了帕金森病的發病過程[18]。本研究結果顯示,DRD5缺失后Gastranaerophilales菌屬的豐度明顯增加,提示DRD5的表達可影響帕金森病的發生發展。本研究結果顯示,敲除組小鼠中雙歧桿菌屬豐度明顯降低。雙歧桿菌有助于腸道微生態平衡,促進腸上皮細胞分泌黏蛋白,促進潘氏細胞分泌sIgA,在腸道局部產生免疫作用,對全身免疫反應也有一定調節作用[19]。梭狀芽孢桿菌ASF356的豐度與脂多糖(LPS)水平呈負相關,而與短鏈脂肪酸呈正相關[20]。本研究結果發現,敲除組小鼠中梭狀芽孢桿菌ASF356的相對豐度明顯降低。布勞特菌屬是一種具有抗炎特性的腸道共生菌,腸道中布勞特菌屬的豐度與移植物抗宿主病的病死率降低和總存活率提高有關[21]。敲除組小鼠中,布勞特菌屬的豐度明顯增加。

本研究初步揭示DRD5缺失小鼠和野生型小鼠腸道菌群結構和多樣性具有明顯差異,未來在臨床中可通過選擇DRD5激動劑或抑制劑治療相關疾病,如DRD5激動劑可通過提高雙歧桿菌的相對豐度,促進腸道微生態的平衡,治療腸道炎癥。但本研究尚存在一定的局限性:由于16S rRNA基因測序技術的局限性及小鼠樣本量不足,后續將增大樣本量并采用宏基因測序技術找出差異基因,進一步探討DRD5影響腸道菌群結構和多樣性的內在機制,為不同疾病的診治提供依據。