基于轉化生長因子β1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白探討黃芩苷對糖尿病模型大鼠的腎功能保護作用及機制*

李進冬，高 一，李智勤，花慧蓮△

（1. 江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300； 2. 江蘇省新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004； 3. 南京醫科大學康達學院，江蘇 連云港 222000）

糖尿病（DM）晚期最常見的微血管并發癥糖尿病腎病（DN）是導致腎功能衰竭的主要原因，嚴重影響患者的生活質量［1］。腎小管間質纖維化（RIF）幾乎是所有慢性腎臟病進展到終末期腎衰竭的共同途徑［2］，涉及成纖維細胞增殖與細胞外基質（ECM）過度沉積，膠原纖維合成增多是RIF 最顯著的特征。導致DN 發生與發展的主要因素為長期慢性高血糖、晚期糖基化終產物、生長因子及喂乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路等，而長期高血糖是DN發展的主要危險因素，mTOR 信號通路參與了ECM 的沉積及腎小管間質的纖維化［3-4］。轉化生長因子β1（TGF-β1）過度表達、mTOR過度激活是基質蛋白生成增加和降解減少的主要原因。臨床防治DN 主要強調維持血糖及血壓穩定的重要性［5］，并無專門針對DN 發病靶點的干預而設計的藥物。黃芩苷是從黃芩中提取的一種黃酮類化合物，具有抗菌、利尿、消炎和抗感染等藥理作用，可改善DM 患者的腎功能［6］。故本研究中基于TGF - β1/mTOR 探討了黃芩苷對DM 模型大鼠的作用及其機制，為臨床早期防治DN提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BX43F型顯微鏡（日本Olympus公司）；Odyssey Sa型紅外激光成像系統（美國LI-cor公司）。

試藥：黃芩苷（純度＞98%）、鏈脲佐菌素（STZ），均購自美國Sigma 公司；TGF - β1、mTOR 抗體（英國Abcam 公司）；肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）試劑盒（長春匯力生物技術公司）；TGF-β1試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；尿蛋白定量試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），均購自南京建成生物工程研究所。

動物：30 只SD 雄性大鼠（體質量180～200 g）購于斯貝福（蘇州）生物技術有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（蘇）2022-0006，飼養于江蘇瀚江生物科技有限公司屏障系統內，恒溫（22～26 ℃）、恒濕（相對濕度40%～60%）環境喂養。動物實驗經江蘇瀚江生物科技有限公司實驗動物福利與倫理委員會批準，所有操作均遵守《實驗動物使用規范》。

1.2 方法

造模、分組及給藥：將30只大鼠隨機分為空白對照組（A組）、模型對照組（B組）、黃芩苷組（C組），各10只。除A 組外，B組和C組大鼠一次性腹腔注射STZ（臨用前溶于pH 4.4的0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中）30 mg/kg。注射72 h 后，尾靜脈采血，測定空腹血糖（FBG），FBG ＞13.9 mmol/ L 即為造模成功。C 組大鼠灌胃30 mg/ kg黃芩苷，A 組和B 組大鼠灌胃等量1%羧甲纖維素鈉（CMC-Na）溶液，均每日1次，連續14周。

血糖、腎質量指數及體質量測定：干預14 周后，經尾靜脈采血測FBG；稱定體質量，處死大鼠；剖開大鼠腹腔，取出腎臟，去除包膜，冰生理鹽水沖洗后用濾紙吸干，稱定質量，計算腎臟質量指數（兩腎質量/ 體質量，mg/g），去除腎髓質，取1/4 腎組織置4%多聚甲醛中固定，備用。

腎功能測定：收集大鼠24 h 尿液，按試劑盒步驟，測定Cr、BUN、24 h尿蛋白定量。

酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測腎組織氧化應激指標：取新鮮腎組織，按組織-冰生理鹽水（1∶9，g/mL）勻漿后離心，取上清液，按試劑盒步驟測定SOD及MDA含量。

腎組織病理染色：取固定腎組織，脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟后分別采用蘇木精-伊紅（HE）、馬松（Masson）、天狼星紅（Sirius Red）染色，光鏡下觀察形態變化，Masson染色膠原纖維呈藍綠色，天狼星紅染色膠原纖維呈紅色。采用Image-pro plus 6.0軟件進行定量分析。

免疫組化法檢測腎組織中層粘連蛋白（LN）含量：腎組織用石蠟包埋，切片，采用免疫組化法檢測LN 含量。按試劑盒步驟染色，光鏡下觀察，采用Image - pro plus 6.0軟件測量棕色陽性區占觀察視野的面積比。

免疫印跡（Western blot）法檢測腎組織中TGF - β1及mTOR蛋白表達水平：取腎組織20～30 mg，加入200 μL裂解液，充分勻漿混勻，冰上裂解30 min，每隔10 min渦旋1次，4 ℃、12 000g離心15 min，上清液轉移至EP管，采用BCA 法測定蛋白濃度。按步驟配膠，上樣，電泳，轉膜，4 ℃封閉1 h，加一抗孵育，4 ℃過夜，洗滌，加熒光二抗（1∶1 000），孵育1 h 后洗滌，將干燥后的條帶置紅外成像系統，拍照。采用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0 統計學軟件分析，計量資料用±s表示，組間比較行t檢驗，多組間比較行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FBG、體質量與腎臟質量指數

與A 組比較，B 組大鼠的FBG 和腎臟質量指數均顯著升高（P＜0.01），體質量顯著降低（P＜0.01）。與B 組比較，C 組大鼠FBG 和腎臟質量指數均顯著降低（P＜0.05）。詳見表1。

表1 黃芩苷對糖尿病模型大鼠FBG、體質量與腎臟質量指數的影響（X±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on FBG，body mass and renal mass index in DM rats（±s，n=6）

表1 黃芩苷對糖尿病模型大鼠FBG、體質量與腎臟質量指數的影響（X±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on FBG，body mass and renal mass index in DM rats（±s，n=6）

注：與A 組比較，*P ＜0.01；與B 組比較，#P ＜0.05。圖1 至圖5同。Note：Compared with those in group A，*P ＜0.01；Compared with those in group B，#P ＜0.05（for Tab.1，Fig.1 and Fig.5）.

組別A組B組C組FBG（mmol/L）8.21±2.36 26.02±3.56*19.34±1.86#體質量（g）301.73±20.78 157.52±22.84*186.25±23.84腎臟質量指數（mg/g）8.75±1.07 18.07±3.62*13.52±2.10#

2.2 24 h 尿蛋白定量、BUN 與Cr 水平

與A 組比較，B 組大鼠24 h 尿蛋白定量及BUN，Cr水平均顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，C組大鼠以上指標均顯著降低（P＜0.05）。詳見圖1。

注：與B組比較，##P ＜0.01。圖2至圖5同。圖1 黃芩苷對糖尿病模型大鼠24 h尿蛋白定量、BUN與Cr水平的影響Note：Compared with those in group B，##P ＜0.01（for Tab.1 - 5）.Fig.1 Effect of baicalin on 24 h urinary protein content，BUN and Cr levels in DM rats

2.3 腎組織中SOD 與MDA 含量

與A 組比較，B 組大鼠腎組織中SOD 含量顯著降低，MDA 含量顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織中SOD 含量顯著升高（P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織SOD與MDA含量的影響Fig.2 Effect of baicalin on the SOD and MDA content in the renal tissue of DM rats

2.4 腎組織纖維化程度

A 組大鼠腎組織可見少量膠原纖維沉積。與A 組比較，B 組大鼠腎小球毛細血管腔變窄，系膜區外基質沉積和膠原沉積均顯著增加（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織纖維化程度顯著減輕（P＜0.05）。詳見圖3。

圖3 黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織纖維化的影響（×400）Fig.3 Effect of baicalin on renal fibrosis in DM rats（×400）

2.5 腎組織LN 表達水平

與A 組比較，B 組大鼠腎組織LN 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組大鼠腎組織LN 水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織LN表達水平的影響（×400）Fig.4 Effect of baicalin on LN expression levels in the renal tissue of DM rats（×400）

2.6 腎組織TGF-β1 與mTOR 蛋白表達水平

與A 組比較，B 組大鼠腎組織TGF-β1及mTOR 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與B組比較，C組大鼠腎組織TGF - β1及mTOR 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。詳見圖5。

圖5 黃芩苷對糖尿病模型大鼠腎組織TGF-β1與mTOR蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of baicalin on TGF-β1 and mTOR protein expression levels in the kidney tissue of rats

3 討論

DM 為常見慢性代謝性疾病，以血糖持續性升高為特征，可使機體血管和神經受累，在相應部位出現病變，最終出現威脅生命的嚴重并發癥。DN 是DM 微血管并發癥之一，是導致終末期腎病（ESRD）的重要原因［7］。DN 的病理變化主要包括腎小球肥大、基底膜增厚、ECM 積聚、腎臟纖維化等［8-9］，其中系膜細胞異常增殖的主要原因為氧化應激，線粒體是系膜細胞中氧化應激的主要來源［10］。高血糖是DN 發生與發展的始動因素，可誘發腎小管肌成纖維細胞激活，從而分泌大量ECM，如Ⅳ型膠原蛋白（COL Ⅳ）、纖維連接蛋白（FN）等，在腎間質中積聚，最終影響腎功能［11］。臨床研究顯示，黃芩苷對DM 早期腎臟病變有一定療效［6，12］，但具體機制尚未闡明。

TGF-β1是一種調節細胞生長分化的多肽因子，能刺激腎小球肥大，能通過Smad 通路依賴和非依賴途徑調節ECM 的合成與降解［13］。DN 狀態下，mTOR 通路激活后刺激腎小球和腎小管肥大［14］，損傷足細胞，引起腎小球濾過率下降。同時，TGF - β1參與RIF，活化的mTOR 途徑可增加促纖維化細胞因子，如TGF-β1及其表達結締組織生長因子，且導致DM 患者的RIF［15］。本研究中對TGF- β1及mTOR 靶點進行干預，結果顯示，與B 組比較，C 組大鼠FBG、腎臟質量指數、24 h 尿蛋白定量及Cr，BUN，MDA，LN 水平均顯著降低，SOD 含量顯著升高（P＜0.05），腎組織纖維化程度顯著減輕（P＜0.05），TGF - β1及mTOR 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），表明經黃芩苷干預后，大鼠腎功能趨于穩定，腎組織纖維化程度減輕，腎組織氧化應激水平降低，通過抑制TGF-β1及mTOR 在腎臟的過表達減少了膠原蛋白的沉積，從而延緩了DN的進展。

綜上所述，黃芩苷可抑制DM 模型大鼠腎臟ECM積聚，降低氧化應激水平，延緩DN 進展，其作用機制可能與抑制TGF-β1/mTOR信號通路有關。